摘要
细胞质雄性不育(Cytoplasmic male sterility,CMS)普遍存在于水稻、油菜、棉花等农作物中,并在作物杂种优势研究利用中发挥了重要作用。在玉米、水稻、高粱等作物中已经成功克隆了育性恢复基因,但在棉花中还未见其克隆成功的报道。同时由于棉花的恢复基因资源较少,所以虽有部分三系杂交种通过审定,但目前杂交制种主要还是靠人工去雄授粉。本研究以陆地棉胞质不育系3096A为母本,具有较强恢复力的恢复系866R为父本杂交,配制F_2群体,调查群体的分离比例,取30株完全可育和30株完全不育的F_2单株分别构建极端性状混池的样品,借助Illumina Hi SeqTM 2500测序平台,使用SLAF-seq(Specific-locus amplified fragment sequencing)技术对2个亲本和F_2分离群体进行测序分析,获得了与育性恢复基因紧密关联的分子标记和候选区域,并对候选区域内基因进行功能注释和富集分析,筛选出与棉花育性恢复相关的候选基因。共开发了165 007个SLAF标签,SLAF标签的平均深度为197.34x。将育性恢复基因定位于D05染色体上碱基序列37535705~37755 211(0.22Mb)、39558 551~40416294(0.86Mb)和40531 406~40 804 095(0.27 Mb)区间内,参考陆地棉基因组数据将育性恢复基因关联区域明确到物理图谱中,关联区域内包含20个基因。将这20个基因分别在NR、SwissProt、GO、COG、KEGG数据库进行BLAST比对,最终获得19个基因的注释信息。此外,对不育系和恢复系进行全基因组重测序,序列比对发现恢复系与参考基因组在关联区域内存在结构变异(Structure variation,SV)位点,而不育系与参考基因组间不存在SV;恢复系与参考基因组在关联区域内发现1607个插入缺失位点(Insertion/de1etion,InDel);13 175个单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphisms,SNP)位点,初步分析这些变异涉及到20个候选基因中的7个。后续我们还会对上述20个候选基因在保持系、不育系、恢复系及子代F_1的叶片、幼蕾及花药中进行RT-qPCR分析,并进行验证,以期能够获得陆地棉胞质不育系的恢复基因。
引文