云南金花茶SSR-PCR反应体系的建立与优化
|
摘要
以云南金花茶为试验材料,利用试剂盒法、SDS法及CTAB法3种方法提取其DNA,并对3种方法的提取结果进行比较;经初筛合成云南金花茶EST-SSR引物,并对影响SSR-PCR体系的Mg~(2+)、Taq DNA聚合酶、dNTP、引物及模板DNA这5个因素进行L_(16)(45~)正交实验,以期建立较为稳定的云南金花茶SSR-PCR体系。试验结果表明:试剂盒法提取得到的云南金花茶DNA质量最好且符合SSR分子标记试验。各因素对PCR扩增效果的影响程度为:Mg2+>引物> Taq DNA聚合酶> dNTP>模板DNA。试验最终确定的金花茶SSR-PCR最佳反应体系(20μL)为:2.0μL Taq Buffer、1.5μL Mg2+(25 mmol/L)、0.3μL dNTP(10 mmol/L)、0.2μL Taq DNA聚合酶(5 U/μL)、前后引物各0.4μL(10μmol/L)、0.5μL模板DNA(50 ng/μL)、14.7μL ddH_2O。建立和优化云南金花茶SSR反应体系,可为云南金花茶不同种群的遗传变异研究提供基础。
The DNA of Camellia fascicularis was extracted with the kit method, SDS method and CTAB method, and the results were comparable. EST-SSR primers of C.fascicularis were synthesized by preliminary screening. Then the L_(16)(4~5) orthogonal experiment was conducted to test the five factors affecting SSR-PCR system, Mg2+, Taq DNA polymerase, dNTP, primers and template DNA so as to establish a relatively stable system of C.fascicularis. SSR-PCR. The results showed that the quality of DNA extracted by kit method was the best and could to be used for SSR molecular marker test. The degree of influence of various factors on PCR amplification was Mg> primer > Taq DNA polymerase > dNTP > template DNA. The optimum SSR-PCR reaction system(20 μL) was 2.0 μL Taq Buffer,1.5 μL Mg~(2+)(25 mmol/L), 0.3 μL dNTP(10 mmol/L), 0.2 μL Taq DNA polymerase(5 U/μL), 0.4 μL(10 μmol/L), 0.5 μL template DNA(50 ng/μL) and 14.7μL ddH_2 O, respectively. Establishing and optimizing the SSR reaction system of C.fascicularis could provide the preliminary practical basis for the genetic variation of different populations of C.fascicularis.
The DNA of Camellia fascicularis was extracted with the kit method, SDS method and CTAB method, and the results were comparable. EST-SSR primers of C.fascicularis were synthesized by preliminary screening. Then the L_(16)(4~5) orthogonal experiment was conducted to test the five factors affecting SSR-PCR system, Mg2+, Taq DNA polymerase, dNTP, primers and template DNA so as to establish a relatively stable system of C.fascicularis. SSR-PCR. The results showed that the quality of DNA extracted by kit method was the best and could to be used for SSR molecular marker test. The degree of influence of various factors on PCR amplification was Mg> primer > Taq DNA polymerase > dNTP > template DNA. The optimum SSR-PCR reaction system(20 μL) was 2.0 μL Taq Buffer,1.5 μL Mg~(2+)(25 mmol/L), 0.3 μL dNTP(10 mmol/L), 0.2 μL Taq DNA polymerase(5 U/μL), 0.4 μL(10 μmol/L), 0.5 μL template DNA(50 ng/μL) and 14.7μL ddH_2 O, respectively. Establishing and optimizing the SSR reaction system of C.fascicularis could provide the preliminary practical basis for the genetic variation of different populations of C.fascicularis.
引文
[1]吴征镒.云南植物志:第八卷[M].昆明:云南科技出版社,1997.
[2]张宏达,任善湘.中国植物志.第四十九卷,被子植物门双子叶植物纲山茶科(一)山茶亚科[M].科学出版社,1998.
[3]张贵良,张贵生,张昆,等.云南金花茶野生资源调查与分析[J].广东林业科技,2015,31(1):45-48.
[4]TAUTZ D,RENZ M.Simple sequences are ubiquitous repetitive components of eukaryotic genomes[J].Nucleic Acids Res.,1984(12):4127-4138.
[5]王玲玲,陈东亮,黄丛林,等.SSR分子标记技术在植物研究中的应用[J].安徽农业科学,2017,45(36):123-126.
[6]王娟娟,赵明,韩雨威,等.微卫星DNA标记开发技术进展及其在经济植物研究中的应用[J].生命科学研究,2016,20(3):260-266.
[7]睢鑫洲,郑毅,仇玉萍,等.4个西南桦品系的遗传多样性分析[J].西南林业大学学报,2017,37(3):21-25.
[8]包文泉,乌云塔娜,赵罕,等.基于SSR标记的仁用杏主栽品种鉴别和指纹图谱构建[J].西北农林科技大学学报,2017,45(6):163-169.
[9]李爽,张军科,党伟锋.苹果遗传连锁图谱构建及抗早期落叶病的基因定位[J].北方园艺,2011(24):145-149.
[10]蔡年辉,许玉兰,王大玮,等.思茅松EST-SSR标记在几种松属植物中的通用性分析[J].西南林业大学学报,2017,37(4):8-14.
[11]朱颖,楚永兴.云南金花茶优良无性系选择初报[J].山东林业科技,2017,47(3):26-28.
[12]张贵良,汪梦婷,刘云,等.云南金花茶花的矿质元素及功能成分分析[J].福建热作科技,2017,42(2):32-34.
[13]汪梦婷,张贵良,刘云,等.云南金花茶矿质元素及功能成分分析[J].黑龙江农业科学,2018(4):118-121.
[14]罗强,恒春娜,段世华.山茶属(Camellia L.)植物叶片基因组DNA不同提取方法的比较[J].井冈山大学学报,2014,35(4):40-43.
[15]周延清,杨清香,张改娜.生物遗传标记与应用[M].北京:化学工业出版社,2008.
[16]李春喜,邵云,姜丽娜.生物统计学[M].4版.北京:科学出版社,2008.
[17]冯富娟,赵丹,孙晓艳,等.红松SSR-PCR反应体系的建立与优化[J].经济林研究,2010,28(1):35-40.
[18]何正文,刘运生,陈立华,等.正交设计直观分析法优化PCR条件[J].湖南医科大学学报,1998,23(4):403-404.
[19]张路红,蒋丽娟,陈景震,等.油料植物光皮树SSR-PCR反应体系优化及引物筛选[J].经济林研究,2017,35(2):78-83.
[20]唐健民,陈宗游,韦霄,等.东兴金花茶SSR-PCR反应体系的优化及引物筛选[J].基因组学与应生物学,2014,33(2):398-404.
[21]黄芳芳,何长青,闫丽君,等.观光木SSR-PCR反应体系优化及引物筛选[J].中南林业科技大学学报,2015,35(10):142-146.
[22]王大玮,保云莹,唐红燕,等.思茅松SSR-PCR反应体系优化研究[J].西南林业大学学报,2018,38(5):34-37.
[23]湛欣,鲁好君,赵帅,等.红椿SSR-PCR体系建立和多态性引物筛选[J].林业科学研究.2016,29(4):565-570.
[24]刘家艳,权俊萍,沈薛洁,等.川山茶ISSR-PCR及SSR-PCR优化体系建立及比较[J].江苏林业科技,2016,43(5):1-7.
[25]贾新平,孙晓波,梁丽建,等.二月兰SSR-PCR反应体系的优化及引物筛选[J].中国农学报,2017,33(5):40-46.
[26]吴帆,柳新红,蒋冬月,等.典型樱亚属植物基因组DNA改良提取方法研究[J].中国野生植物资源,2017,36(2):24-27.
[2]张宏达,任善湘.中国植物志.第四十九卷,被子植物门双子叶植物纲山茶科(一)山茶亚科[M].科学出版社,1998.
[3]张贵良,张贵生,张昆,等.云南金花茶野生资源调查与分析[J].广东林业科技,2015,31(1):45-48.
[4]TAUTZ D,RENZ M.Simple sequences are ubiquitous repetitive components of eukaryotic genomes[J].Nucleic Acids Res.,1984(12):4127-4138.
[5]王玲玲,陈东亮,黄丛林,等.SSR分子标记技术在植物研究中的应用[J].安徽农业科学,2017,45(36):123-126.
[6]王娟娟,赵明,韩雨威,等.微卫星DNA标记开发技术进展及其在经济植物研究中的应用[J].生命科学研究,2016,20(3):260-266.
[7]睢鑫洲,郑毅,仇玉萍,等.4个西南桦品系的遗传多样性分析[J].西南林业大学学报,2017,37(3):21-25.
[8]包文泉,乌云塔娜,赵罕,等.基于SSR标记的仁用杏主栽品种鉴别和指纹图谱构建[J].西北农林科技大学学报,2017,45(6):163-169.
[9]李爽,张军科,党伟锋.苹果遗传连锁图谱构建及抗早期落叶病的基因定位[J].北方园艺,2011(24):145-149.
[10]蔡年辉,许玉兰,王大玮,等.思茅松EST-SSR标记在几种松属植物中的通用性分析[J].西南林业大学学报,2017,37(4):8-14.
[11]朱颖,楚永兴.云南金花茶优良无性系选择初报[J].山东林业科技,2017,47(3):26-28.
[12]张贵良,汪梦婷,刘云,等.云南金花茶花的矿质元素及功能成分分析[J].福建热作科技,2017,42(2):32-34.
[13]汪梦婷,张贵良,刘云,等.云南金花茶矿质元素及功能成分分析[J].黑龙江农业科学,2018(4):118-121.
[14]罗强,恒春娜,段世华.山茶属(Camellia L.)植物叶片基因组DNA不同提取方法的比较[J].井冈山大学学报,2014,35(4):40-43.
[15]周延清,杨清香,张改娜.生物遗传标记与应用[M].北京:化学工业出版社,2008.
[16]李春喜,邵云,姜丽娜.生物统计学[M].4版.北京:科学出版社,2008.
[17]冯富娟,赵丹,孙晓艳,等.红松SSR-PCR反应体系的建立与优化[J].经济林研究,2010,28(1):35-40.
[18]何正文,刘运生,陈立华,等.正交设计直观分析法优化PCR条件[J].湖南医科大学学报,1998,23(4):403-404.
[19]张路红,蒋丽娟,陈景震,等.油料植物光皮树SSR-PCR反应体系优化及引物筛选[J].经济林研究,2017,35(2):78-83.
[20]唐健民,陈宗游,韦霄,等.东兴金花茶SSR-PCR反应体系的优化及引物筛选[J].基因组学与应生物学,2014,33(2):398-404.
[21]黄芳芳,何长青,闫丽君,等.观光木SSR-PCR反应体系优化及引物筛选[J].中南林业科技大学学报,2015,35(10):142-146.
[22]王大玮,保云莹,唐红燕,等.思茅松SSR-PCR反应体系优化研究[J].西南林业大学学报,2018,38(5):34-37.
[23]湛欣,鲁好君,赵帅,等.红椿SSR-PCR体系建立和多态性引物筛选[J].林业科学研究.2016,29(4):565-570.
[24]刘家艳,权俊萍,沈薛洁,等.川山茶ISSR-PCR及SSR-PCR优化体系建立及比较[J].江苏林业科技,2016,43(5):1-7.
[25]贾新平,孙晓波,梁丽建,等.二月兰SSR-PCR反应体系的优化及引物筛选[J].中国农学报,2017,33(5):40-46.
[26]吴帆,柳新红,蒋冬月,等.典型樱亚属植物基因组DNA改良提取方法研究[J].中国野生植物资源,2017,36(2):24-27.