海洋裂殖壶菌DHA生物合成PKS途径的研究
摘要
二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid,简称DHA)是目前发现的碳链最长、不饱和度最高的ω-3长链高度不饱和脂肪酸(Long-chain polyunsaturated fatty acids,Lc-PUFAs),具有抗心血管疾病、抗血脂、降血压、预防各种癌症等重要生理功能.传统的观点认为,DHA是在线粒体或内质网上通过一系列的碳链脱饱和与延长反应生物合成的.但是,近年来,在海洋细菌Shewanella、Mortella marina、Photobacterium profundum中相继发现类似脂肪酸合成酶(Fatty acid synthesis,FAS)的多聚乙酰合成酶(Polyketide synthase,PKS),该酶是多亚基的复合酶,存在于细胞质中.海洋真菌Schizochytrium高产DHA,可作为研究高度不饱和脂肪酸生物合成的模式生物,具有很高的研究价值.18S rRNA基因进化分析表Schizochytrium sp.FJU-512属于Thraustochytrids科,因此推测其DHA的合成途径与同科的Thraustochytrium一样,也是经碳链脱饱和酶与延长酶途径.但是,Meta等用同位素标记证明了Schizochytrium DHA合成部位在细胞质中,因此推测Schizochytrium中可能存在PKS途径.本文通过构建cDNA文库,研究了Schizochytrium sp.FJU-512 DHA生物合成的PKS途径,为转基因技术生产DHA奠定了基础.构建的cDNA文库其原始文库库容为5.0×106cfu,测序得到4338条原始EST序列,平均长度470bp.经phrap拼接,获得了648条contigs、1299条singlets,合计1947条unigenes.通过表达序列标签,获得了Schizochytrium DHA生物合成全部的关键基因,主要有丙二酰辅酶A酰基载体蛋白转移酶、Beta-酮酰合成酶、Beta-酮酰还原酶、羟酯酰辅酶A脱氢酶、烯酯酰辅酶A异构酶以及烯酯酰还原酶等.在Schizochytrium cDNA文库中,同时还获得了完整的电子传递链相关的全部基因,主要有NADH脱氢酶、琥珀酸脱氢酶、细胞色素还原酶、细胞色素氢化酶以及ATP合成酶等.根据上述这些关键酶的功能,可以得到Schizochytrium DHA生物合成完整的PKS途径:①脂酰-ACP与丙二酸单酰-ACP在3-酮脂酰-ACP合成酶的作用下缩合生成3-酮脂酰-ACP,延长了脂酰-ACP的碳链骨架;②3-酮脂酰-ACP在3-酮脂酰-ACP还原酶作用下加氢还原生成3-羟脂酰-ACP;③3-羟脂酰-ACP在烯脂酰-ACP-脱水酶/异构酶的作用下脱去H2O引入双键生成烯脂酰-ACP;④烯脂酰-ACP在烯脂酰-ACP-还原酶(ER)作用下脱氢生成酮脂酰-ACP.在PKS途径中,第③步羟脂酰脱氢与第③步烯脂酰还原通常被省去而直接进行酮基合成,结果生成一系列多酮基化合物前体.这些前体最后经过脱氢或还原,生成高度不饱和脂肪酸.脱下的氢经电子传递链合成ATP.