桑树硝酸还原酶基因MaNR的克隆及其表达分析
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摘要
【目的】以桑树栽培品种桂优62号为材料,克隆桑树硝酸还原酶(nitrate reductase,NR)基因全长c DNA和DNA序列并分析其序列特征,在此基础上研究桑树硝酸还原酶基因在桑树细胞脱分化和分化过程中的表达特征以及影响因素,为进一步阐述硝酸还原酶在桑树生长发育中的作用机制奠定基础。【方法】基于单倍体川桑(Morus notabilis Schneid)基因组数据(http://morus.swu.edu.cn/morusdb)注释的scaffold570序列设计特异引物,硝酸钾处理桑树叶片48 h后使用RNAiso Plus(TaKaRa)和改良CTAB法提取总RNA及基因组DNA,分别以cDNA和DNA为模板,用RT-PCR法克隆获得桑树NR全长cDNA和DNA序列,运用生物信息学手段对推定的氨基酸序列进行分析。以桑胚轴为外植体,在无菌条件下,接种在不同氮源、生长调节物质的培养基中,通过桑树胚轴离体再生过程和real-time PCR方法研究硝酸还原酶基因在离体再生过程中的表达差异以及不同氮源、生长调节物质对NR表达的影响。【结果】克隆获得的桑树NR全长CDS序列,长2 730 bp,编码909个氨基酸,推导的蛋白质分子量为102.84 kD,等电点为6.76。基因组序列长5 142 bp,包含5个外显子和4个内含子,具有完整的5个结构域。通过氨基酸序列比对发现,其序列高度保守,与川桑NR序列同源性达95%,与蔷薇科果树NR序列同源性达78%。聚类分析表明,单子叶植物聚为一组,桑树与蔷薇科果树聚为一组。Gen Bank登录号分别为KF992020.1和KF992021.1。NR在桑根中表达量最高,叶中表达次之,茎中表达最少;谷氨酸显著提高NR在桑叶中的表达量,GA3显著提高NR在桑茎中的表达量。桑胚轴在单一的NH4+-N培养基中,不能被诱导出愈伤组织及丛生芽,在单一的NO3--N培养基中可以诱导出愈伤组织和丛生芽;但丛生芽继代培养在单一NH4+-N的培养基中和单一的NO3--N培养基中都可以生长。real-time PCR结果显示,NR在子叶和胚轴中的表达量高于胚根。桑胚轴在离体诱导愈伤组织和丛生芽分化过程中,NR的表达量逐渐增加,丛生芽形成后NR的表达量降低并趋于稳定。NH4+-N和NO3-N对NR在继代丛生芽中没有显著影响,谷氨酸对NR在继代丛生芽中有抑制作用。
引文