拟穴青蟹(Scylla paramamosain)抗脂多糖因子5(SpALF5)的分子克隆,表达分析及其抗菌活性
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- 论文作者：孙万伟 ; 李升康 ; 张昭 ; 周立镇 ; 朱烁
- 年：2014
- 作者机构：汕头大学理学院海洋生物技术重点实验室;
- 论文关键词：拟穴青蟹 ; SpALF5 ; 抗菌活性
- 会议召开时间：2014-12-19
- 会议录名称：广东省遗传学会第九届代表大会暨学术研讨会论文及摘要汇编
- 英文会议录名称：Theses and Abstracts Compilation of 9th Conference on Genetics,Guangdong
- 语种：中文
- 分类号：S945
- 学会代码：GDKL
- 会议名称：广东省遗传学会第九届代表大会暨学术研讨会
- 会议地点：中国广东广州
- 主办单位：广东省遗传学会
- 学会名称：广东省科学技术协会科技交流部
- 页数：1
- 文件大小：75k
- 原文格式：O
- 会议级别：地方
摘要
目的:拟穴青蟹(S.paramamosain)是中国粤东沿海地区的主要养殖蟹类,由于现代化高密度养殖规模的扩大,拟穴青蟹疾病的爆发日益频繁和严重,给青蟹养殖业造成了巨大的经济损失。抗脂多糖因子(ALF)是无脊椎动物体液免疫中的重要免疫因子,对感染的病原菌起着重要的抗性作用,因此从拟穴青蟹体克隆ALF基因并对其抗菌活性及免疫机制进行深入研究具有非常重要的意义。材料与方法:通过RACE技术从拟穴青蟹血细胞中克隆获得SpALF5的cDNA全长序列,利用生物信息学方法预测蛋白质序列和结构域,分析物种同源性,构建系统进化树;以拟穴青蟹肌肉组织基因组DNA为模板,扩增得到SpALF5的基因组DNA序列,分析结构组成;通过实时荧光定量PCR,探究SpALF5在不同组织的特异性表达分布,并进一步研究在不同应激源刺激下(副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus,Vp),脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS),聚肌胞(Polyinosinic-polytidylin Acid,Poly I:C),生理盐水(control group)),SpALF5在血细胞、脑、肌肉组织中不同时间段的差异表达;构建SpAFL5原核表达载体p32a-ALF5,转化大肠杆菌BL21,通过IPTG(Isopropyl-β-d-thiogalactoside)诱导表达SpALF5重组蛋白(rSpALF5),并用Ni-NTA His.Bind Resin纯化蛋白,纯化获得的蛋白分别与革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌共培养,检测其体外抗菌活性。结论:SpALF5(Genbank ID:HF952161.1)cDNA全长975bp,开放阅读框(ORF)长375bp,共编码125个氨基酸,蛋白质三级结构预测只含有一个功能结构域(Superfamilies DUF3254),与三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)的PtALF4蛋白质序列同源性最高(49%)。近期甲壳纲ALF系统进化树分类显示:SpALF5聚丛于Group D类群。SpALF5基因组DNA序列全长1424bp,由3个内含子和4个外显子组成,内含子两端具有保守的GT-AG框。组织特异性表达结果表明,SpALF5在脑组织中表达量最高,其次是肌肉组织,而在血细胞中表达量最低。应激性表达结果显示:在注射应激源后的不同时间段,SpALF5在体内的转录水平显著性上调。诱导表达并纯化得到的rSpALF5蛋白约为32kDa(含Trx.Tag),在体外对革兰氏阴性菌(Vp、溶藻弧菌、大肠杆菌、嗜水气单胞菌),真菌(酿酒酵母)及某些革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌)具有较强的抗菌活性。以上结果表明,SpALF5是一种潜在的免疫因子并在拟穴青蟹抵抗外源病菌感染中起重要的免疫防御作用。
引文