温度对家蚕BmN细胞昼夜节律负反馈回路基因表达的影响

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• 论文作者：刘安琪 ; 季明明 ; 司马杨虎 ; 徐世清
• 年：2016
• 作者机构：苏州大学医学部基础医学与生物科学学院;现代丝绸国家工程实验室;苏州大学农业生物技术与生态研究院;
• 论文关键词：昼夜节律 ; 温度授时因子 ; 负反馈环路 ; 基因转录 ; 蛋白质含量 ; BmN细胞 ; 家蚕
• 会议召开时间：2016-07-01
• 会议录名称：第十二届家（柞）蚕遗传育种暨良种繁育学术研讨会论文集（摘要汇编）
• 语种：中文
• 分类号：S881.2
• 学会代码：ZGCU
• 会议名称：第十二届家（柞）蚕遗传育种暨良种繁育学术研讨会
• 会议地点：中国重庆
• 主办单位：中国蚕学会、国家蚕桑产业技术体系
• 学会名称：中国蚕学会
• 页数：2
• 文件大小：665k
• 原文格式：D
• 会议级别：全国

摘要

家蚕(Bombyx mori)不仅是鳞翅目的模式昆虫,也是影响着有数千万农民和丝绸工业生产者的产业化生产的昆虫(Goldsmith et al.,2005)。农林害虫近70%属鳞翅目,鳞翅目昆虫生物钟的授时信号输入和输出环路中的核心成员,在蛋白质分子进化和分子相互作用网络等方面与哺乳类具有较大的差异(Kadener et al.,2007;Hirota and Fukada,2004),也与研究较多的双翅目Drosophila melanogaster,膜翅目Apis mellifera和蜚蠊目Periplaneta americana有显著差异(Lehmann et al.,2011;Sakai and Ishida,2001;Sandrelli et al.,2008)。Bombyx mori的生物钟授时机制研究,对于鳞翅目害虫防治和家蚕等昆虫生产有重要意义。光照和温度是昆虫生理和代谢最直接的环境影响因子,也是生物钟最重要的授时因子(Wu et al.,2014)。近年来的大量文献,几乎都是围绕光照授时因子在基因与蛋白质水平对动物行为、机体内部生理与代谢的影响而展开的研究(Edery,2000;Glaser and Stanewsky,2005;Lohmann et al.,2007;Fuller et al.,2008)。昆虫是变温动物,温度直接调控昆虫的孵化与进食、生长与变态、生殖与滞育、呼叫与迁徙等生理行为机制(Liao et al.,2014;Soltani Orang et al.,2014;Hosseinzade et al.,2014;Xu L et al.,2012;Tanaka and Watari,2011;Zhu H et al.,2008)。果蝇中研究发现,2-3℃的周期性温度变化,能够导致其生物钟发生重置与同步(Gentile et al.,2013)。已有的研究报道推测,温度与光照信号的输入途径是不同的独立环路。另一种观点则认为温度与光照虽然作为不同的授时因子,但两者的负反馈信号调节环路存在相互作用(Boothroyd et al.,2007),或者共用一个环路(Fan et al.,2007)。温度的授时因子作用机制研究还有许多不明之处(Fuller et al.,2008;Lohmann et al.,2007;Glaser and Stanewsky,2005),在鳞翅目昆虫中的研究几乎是空白。本文关注的是,怎样的温度变化才能够导致家蚕昼夜节律生物钟核心成员的稳定响应。为此本文以Bm N为模型,调查了温差对家蚕外周生物钟昼夜节律负反馈回路主要基因表达的影响。37℃/30min短时间高温刺激能够诱导细胞内生物钟基因Cry1、Cry2、Per和Tim转录水平上调;基因表达谱出现振荡节律,Cry1的振荡周期缩短,Cry1和Per的振荡相位改变。2℃(26℃:28℃)、5℃(20℃:25℃/25℃:30℃)和10℃(20℃:30℃)周期性温差变化,都能够诱导细胞内这4个钟基因的表达谱和蛋白质含量的周期性变化,其中10℃周期性温度变化影响最为显著。已有研究表明,短时间的光照或者温度刺激是证明生物钟是否响应授时因子的简单有效方法(Tamaru et al.,2011;Sidote et al.,1998)。本文以37℃高温处理家蚕Bm N细胞30 min,主要的生物钟基因Cry1、Cry2、Per和Tim都产生了节律振荡,转录本水平上调、振幅与周期发生了变化。其中Cry1的振荡周期缩短,Cry1和Tim的振荡相位也出现了明显变化。显示家蚕Bm N细胞能够响应37℃/30 min短时间高温刺激。如同温度对变温动物的活动和生长发育有直接影响,温度也直接影响培养家蚕Bm N的生长和代谢。因此,优化授时温度的变化范围是一项基础工作。我们首先在恒明、2℃昼夜温度变化(26℃:28℃)条件下,观察到这4个基因也会响应温度振荡变化信号,从而产生节律变化,但是没有完全同步。表明2℃昼夜温度变化能够诱导Bm N细胞的生物钟基因转录水平发生重置与同步化变化。推测2℃的温差可能无法使得昼夜节律生物钟负反馈回路的4个主要基因转录调控完成同步。进一步以Bm N适宜的培养温度25℃-26℃为基础,以降低或升高5℃的温度变化(20℃:25℃and 25℃:30℃)进行处理,结果在恒明环境中得到了与黑暗环境中不同的结果。显示光照的存在会影响(干扰)温度发挥作用。为此,我们在黑暗和10℃温度变化(20℃:30℃)环境中调查,结果发现生物钟基因Cry1、Cry2、Per和Tim及其翻译蛋白质含量都对温度信号产生了比较稳定的响应,并且产生趋势相近的节律振荡。提示黑暗、10℃昼夜温度变化(20℃:30℃)是研究Bm N细胞的生物钟基因作用的有效处理方法。已有研究虽然都倾向温度对昼夜节律生物钟的授时作用影响,但争论的焦点在温度是与光照授时因子共同起作用,还是具有独立的作用环路(Boothroyd et al.,2007;Fan et al.,2007)。由于鳞翅目昆虫的生物钟基因大多没有克隆和鉴定,相关作用机制研究落后于果蝇和小鼠,家蚕中几乎是空白。本文q PCR的结果表明,在20℃:30℃的温度节律条件下,Cry1、Cry2、Per、Tim基因都产生了显著的节律振荡,其中Cry2、Per和Tim基因的period几乎同步。表明10℃昼夜温度变化诱导了这4个基因转录水平的稳定周期性振荡变化,或者说诱导了Bm N细胞生物钟发生重置与同步化。以Western Blotting方法调查的蛋白质含量变化结果显示,10℃周期性温度变化诱导了CRY1、CRY2、PER和TIM 4种蛋白质含量的振荡变化,其中CRY2和PER含量变化的授时日节律特征更加典型。暗示CRY2和PER在温度授时信号负反馈信号回路调控中可能发挥更加关键的作用。结论是2℃-10℃的周期性温差变化,能够诱导家蚕Bm N细胞生物钟发生重置与同步,其中Cry2和Per基因转录水平及其蛋白质的含量受周期性温差变化的重置与同步效果更好。

引文