环形泰勒虫TaSP基因的克隆、原核表达及PCR诊断方法的建立

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• 论文作者：郑进峰 ; 刘光远 ; 李奎
• 年：2016
• 作者机构：兰州兽医研究所;河南农业大学牧医工程学院;
• 论文关键词：环形泰勒虫 ; TaSP基因 ; 克隆 ; 表达 ; PCR ; 诊断方法
• 会议召开时间：2016-08-20
• 会议录名称：中国畜牧兽医学会动物解剖及组织胚胎学分会第十九次学术研讨会论文集
• 语种：中文
• 分类号：S852.7
• 学会代码：ZGXJ
• 会议名称：中国畜牧兽医学会动物解剖及组织胚胎学分会第十九次学术研讨会
• 会议地点：中国河南郑州
• 主办单位：中国畜牧兽医学会动物解剖及组织胚胎学分会
• 学会名称：中国畜牧兽医学会
• 页数：1
• 文件大小：62k
• 原文格式：O
• 会议级别：全国

摘要

本研究参考GenBank上登录的环形泰勒虫TaSP基因序列设计引物,采用PCR技术从肃北县环形泰勒虫感染牛的全血基因组中扩增到TaSP基因保守区片段,该基因片段长度为396bp,编码312个氨基酸。序列分析表明,该基因与其他9个GenBank中发表的核苷酸序列相似性为83%~94%。遗传演化关系分析表明,环形泰勒虫肃北株与土耳其株、临潭株、内蒙株、摩洛哥株、苏丹株、宁夏珠及德国株处于同一进化分支,与新疆株和突尼斯株进化途径差异较大。在上述研究基础上,成功构建了原核表达载体pGEX-4T-1/TaSP,经IPTG诱导表达后,进行SDS-PAGE、Western-blotting分析。结果表明,pGEX-4T-1/TaSP在大肠杆菌BL21中成功表达出约41KDa的融合蛋白,能被牛环形泰勒虫阳性血清所识别,表明该融合蛋白具有较好的反应原性。根据该基因片段的核苷酸序列推导出氨基酸序列,应用DNAstar Protean软件提供的模块,用Gamier-Robson法从氨基酸残基的晶体结构来预测蛋白质的二级结构,分别按Kyte-Doolittle、Emini、Karplus-Schulz和Jameson-Wolf方案预测其亲水性、表位可能性、柔韧性和抗原性指数。结果显示,TaSP蛋白在10~19,26~36,49~57,73~86,125~130等区域结果一致,各项指标均较高。此外,上述区域在二级结构上含有易形成抗原表位的无规则卷曲结构,因此B细胞表位可能存在于上述区域内。根据TaSP基因序列保守区设计引物建立环形泰勒虫快速PCR诊断方法,特异性实验显示,在被检测的9个样本中,只有环形泰勒虫基因组模版中扩增出了符合大小的特异核酸片段。敏感性试验结果表明,PCR对环形泰勒虫的扩增效率可达到10-10。通过对150份血清样品的检测,并与血涂片方法进行比较,结果显示PCR方法具有特异性强、敏感度高等特点,适用于牛环形泰勒虫病的检测。

引文