牛精原干细胞的分离培养和组蛋白H3K9三甲基化修饰研究

详细信息    查看官网全文

• 论文作者：蔡桓 ; 赵欣欣 ; 汪正铸 ; 马晓玲 ; 唐博 ; 李子义 ; 张学明
• 年：2016
• 作者机构：吉林大学动物医学学院;吉林大学第一医院/转化医学研究院;
• 论文关键词：牛 ; 精原干细胞 ; 分离培养 ; 组蛋白H3K9 ; 甲基化修饰
• 会议召开时间：2016-08-20
• 会议录名称：中国畜牧兽医学会动物解剖及组织胚胎学分会第十九次学术研讨会论文集
• 语种：中文
• 分类号：Q813
• 学会代码：ZGXJ
• 会议名称：中国畜牧兽医学会动物解剖及组织胚胎学分会第十九次学术研讨会
• 会议地点：中国河南郑州
• 主办单位：中国畜牧兽医学会动物解剖及组织胚胎学分会
• 学会名称：中国畜牧兽医学会
• 页数：1
• 文件大小：70k
• 原文格式：O
• 会议级别：全国

摘要

精原干细胞(spermatogonial stem cells,SSCs)是成体内能持续批量更新并将基因传至子代的天然成体干细胞,在干细胞生物学和医学研究及畜牧业生产、濒危动物保护等方面有广阔应用前景。目前有关鼠、人等SSCs的培养、鉴定、更新、分化等研究己取得显著进展,但有关大家畜特别是牛SSCs的研究仍有很多问题,如取材不便、特异性标记有争议、培养体系不成熟、干细胞特性难以维持等。本室前期己报道了牛睾丸组织冻存和精原细胞初步分离富集。本研究进一步对牛睾丸组织的冻存、SSCs分子标记、分离富集、培养、组蛋白甲基化修饰等进行探究。结果显示,血清替代物可替代胎牛血清用于睾丸组织冻存,组织复苏后结构完整、清晰,可用于精原细胞的分离富集。荧光定量PCR显示,牛生精上皮表达一定水平的多能性基因(Oct4、Sox2、Nanog)和较高水平的生殖细胞标记基因(Gfrα-1、Plzf);免疫荧光染色显示,牛曲细精管细胞中有GFRα-1信号,可作为牛SSCs的标志物。进而制备了生精上皮细胞悬液,进一步探讨了差异贴壁法和Percoll密度梯度离心法对牛SSCs富集的效果,GFRα-1标记后流式分析显示,联合使用这两种方法可有效提升牛SSCs的富集度。鉴于近年来小分子抑制剂(如CHIR99021和PD0325901,分别为细胞外调节蛋白激酶ERK和糖原合成激酶3βGSK3β的抑制剂,合称2i)在胚胎干细胞和诱导多能性干细胞中的重要作用,本研究探讨了2i培养体系对牛SSCs干性的维持效果。荧光定量PCR显示,2i条件显著上调了多能性基因(Oct4、Sox2、Nanog)、SSCs标记基因(Gfrα-1、Plzf)、抗凋亡基因(Bcl2)及白血病抑制因子受体基因(LIFR)的表达,而抑制精原细胞分化基因(c-kit)和促凋亡基因(Bax)的表达,同时也提升了SSCs标志物PLZF的表达;用双氧水诱导SSCs凋亡,发现2i能有效抵御凋亡刺激。以上结果提示2i条件有利于牛SSCs体外培养中干性的维持。由于组蛋白甲基化修饰与小鼠SSCs的干细胞状态有密切关系,本实验还初步探究了2i条件对牛SSCs组蛋白H3赖氨酸(K9)三甲基化修饰(H3K9me3)的影响。结果显示,2i能显著降低其H3K9me3水平;培养的牛曲细精管组织中表达组蛋白甲基化酶Suv39h1、Suv39h2、SetDB1和Kdm4A基因;荧光定量PCR显示2i条件显著降低Suv39h1/h2的表达。这提示2i条件可能通过Suv39h1/h2介导牛SSCs的H3K9me3修饰。综上,本研究在冷冻保存牛睾丸组织、分离、富集、鉴定SSCs的基础上,初步证实了小分子抑制剂2i在牛SSCs干性维持中的作用及其对SSCs组蛋白H3K9me3表观修饰水平的影响,为后续研究奠定了基础。

引文