猪带绦虫Wnt基因家族在不同发育阶段的qPCR分析
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- 论文作者：侯俊玲 ; 骆学农 ; 郑亚东 ; 张少华 ; 才学鹏
- 年：2016
- 作者机构：中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室甘肃省动物寄生虫病重点实验室;
- 论文关键词：猪带绦虫 ; Wnt基因家族 ; 内参基因 ; qPCR
- 会议召开时间：2016-08-08
- 会议录名称：中国动物学会寄生虫学专业委员会第十届全国寄生虫学青年工作者学术研讨会论文摘要集
- 英文会议录名称：The Abstracts of the Tenth Symposium for Yong Scientists of China Society of Parasitology
- 语种：中文
- 分类号：S852.734
- 学会代码：JISC
- 会议名称：中国动物学会寄生虫学专业委员会第十届全国寄生虫学青年工作者学术研讨会
- 会议地点：中国四川成都
- 主办单位：中国动物学会寄生虫学专业青年委员会
- 学会名称：中国动物学会寄生虫学专业委员会
- 页数：1
- 文件大小：604k
- 原文格式：D
- 会议级别：全国
摘要
目的:Wnt是一类大小约40kDa,含有22~24个高度保守的半胱氨酸残基的蛋白家族。该家族直接控制着细胞的增殖、分化、极化和凋亡,并调节干细胞的自我更新,是一类调控动物生长发育的重要分子。通过分析未激活猪囊尾蚴和激活猪囊尾蚴的转录组数据,发现Wnt信号途径分子在猪囊尾蚴被激活后表达呈现明显的上调。本研究通过qPCR实验来验证Wnt家族成员及不同信号途径分子的表达差异,并确定猪囊尾蚴在激活后参与虫体发育的Wnt家族成员。方法:首先从猪带绦虫基因组数据库中选择候选内参基因和目的基因,并从数据库中获取基因序列,采用Primer Express 2.0软件设计qPCR引物,并用NCBI数据库的在线软件Primer-BLAST检测引物的特异性。猪囊尾蚴在体外经猪胆汁激活后,用TRIzol提取激活和未激活猪囊尾蚴的Total RNA,然后,用RNAase-free的DNAaseΙ消化处理Total RNA,去除基因组DNA污染。Total RNA经M-MLV c DNA合成试剂盒反转录成cDNA后,以未激活和激活猪囊尾蚴的cDNA为模板进行梯度稀释,每个稀释度设3个重复孔,采用Platinum®SYBR®Green定量PCR Super Mix-UDG试剂盒进行qPCR实验。首先用ge Norm软件分析内参基因的Ct值,计算基因表达稳定度的平均值M,选择M值最小的基因做为内参。然后,根据Ct值绘制目的基因的标准曲线,确定其扩增效率,根据相关公式算出目的基因的相对差异倍数。结果:把候选内参基因数据导入ge Norm软件,通过候选基因的稳定度排序,确定GAPDH为内参基因。采用2-△△Ct相对定量PCR的统计方法分析Wnt家族基因及其信号通路分子mRNA在猪囊尾蚴激活前后的转录差异。结果发现,猪囊尾蚴Wnt基因家族中Wnt4和Wnt11b在激活后表达明显上调,而Wnt信号通路中的目的分子在激活后表达都明显上调,尤以Wnt/β-Catenin经典途径的靶分子LEF1和Wnt/Ca2+依赖途径的靶分子NFAT上调最为显著。结论:确定GAPDH为内参基因。确定在激活的猪囊尾蚴中,Wnt4、Wnt11b、Wnt/β-Catenin经典途径的靶分子LEF1和Wnt/Ca2+依赖途径的靶分子NFAT都明显上调。qPCR实验结果与转录组测序结果一致。
引文