冻干羊胎免疫调节因子及其稳定性初步研究
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摘要
羊胎免疫调节因子(goat embryo immunoregulatory factor, GEIF)，是以羊胎为原料经超滤等工艺制成的生物活性物质。利用羊胎免疫调节因子超滤液作为原料研发保健品符合现代食品科学的发展趋势，但羊胎免疫调节因子的稳定性是其应用中存在的问题。因此，如何提高其活性物质的稳定性、改进质量，使产品利于质量控制，已成为亟待解决的问题。
本文利用添加保护剂和真空冷冻干燥技术，将GEIF超滤液(分子量＜3000道尔顿)制成冻干GEIF，以期增加产品稳定性、提高质量、延长货架期，并在一定程度上解决贮存和运输条件较为严格的问题，使产品利于质量控制。本试验筛选了最优冻干配方和冻干工艺参数，并将冻干GEIF与GEIF超滤液比较分析，进而对冻干GEIF的稳定性作了初步研究。本试验研究为冻干羊胎免疫调节因子保健品的研发提供了一定的实验依据，也可为相关的以多肽类为功效成分的保健食品的研发提供一定参考。试验结果表明：
1．甘露醇、蔗糖均可赋予冻干GEIF一定的外观性状，但因各自理化性质的不同，使得冻干GEIF的外观性状存在差异，主要表现为粗糙度不同。
2．甘露醇、蔗糖对GEIF的免疫活性具有不同冻干保护作用和贮存稳定性作用。作为缓冲剂的柠檬酸钠表现出相对较差的稳定性作用。从冻干保护效果和冻干稳定性效果综合考虑，选取4％(g／ml)甘露醇配比1％(g／ml)蔗糖的配方为最优配方。
3．以外观性状、免疫活性、水分含量为主要指标，从冻干和稳定效果考察，通过正交试验选得真空冷冻干燥的最佳工艺参数为第一阶段干燥温度-10℃、干燥时间25h；第二阶段干燥温度20℃、干燥时间10h。保护剂的配比为影响冻干效果的主要因素，对稳定效果则保护剂的配比和第一阶段干燥时间同为主要因素。根据最优组合得到的冻干曲线可作为放大生产的有效参考。
4．用紫外扫描和高效液相色谱对GEIF超滤液和冻干GEIF进行分析比较。两者的最大紫外吸收波长为250±1nm，紫外吸收峰值＜1.5；GEIF超滤液和冻干GEIF均分离出20个峰，两者图谱的相对峰面积在2％以上的峰，其保留时间和各组分相对百分含量这两个特征指标无显著性差异(P＞0.05)，图谱有相当好的吻合性。这初步表明GEIF超滤液经添加保护剂和真空冷冻干燥后，其主要成分没有发生显著性改变，保护剂的选择在理论和实际上均符合原则，添加的保护剂不影响冻干GEIF质量标准
冻于羊胎免疫调节因子及其稳定性初步研究
中紫外扫描和色谱指标的检测。
5．在4’C、20’C、37C下，经30天留样考察，GEIF超滤液受温度影响较大，而
冻干GEIF受温度影响较小。4℃、30天，两者均能保持良好活性；20℃、30天，GEIF
超滤液的免疫活性较冻干GEIF有所降低；37oC、30天，冻干GEIF的免疫活性极显
著高于GE F超滤液的免疫活性0功＊人＊mF超滤液应在2～8℃保存。
6．在相对湿度900土50和75O土50下，经30天留样考察，冻干GEIF因其特有
的多孔疏松结构极易吸潮，导致外观性状的改变和活性的丧失。若采用优质包村并包
装良好，可明显减轻在贮存和运输中环境相对湿度对产品的影响。
7．对冻干GEIF稳定性的初步研究表明，添加保护剂和采用真空冷冻干燥能在一
定程度上提高GEIF的稳定性。
Goat embryo immunoregulatory factor (GEIF) was the biological product developed from goat embryo with the ultrafiltration. In this paper, ultrafiltrated GEIF(molecular weight<3000dalton) was transformed into freeze-dried GEIF using vacuum freeze-drying technology and adding protectants or excipients. Freeze-dying formulation and parameters were optimized. Comparisons of ultrafiltrated GEIF and freeze-dried GEIF, stability of freeze-dried GEIF had also been studied. The results indicated:
Mannitol and sucrose could give the appearance to freeze-dried GEIF. The appearance of freeze-dried GEIF varied with the different physical and chemical characters of the protectants. The main difference was shown by the degree of crystalline particles and coarseness.
The immunoregulation activity of ultrafiltrated GEIF could be protected by mannitol and sucrose during vacuum freeze-drying. But the effects of each formulation were different. As buffer, sodium citrate did not bring about satisfied stable effect. Considered with the effect of protection and stabilization, 4%(g/ml) mannitol plus 1%(g/ml)sucrose was selected as the optimal formulation.
According to the cake appearance , immunoregulation activity and moisture content, the best vacuum freeze-drying parameters were -10 , 25h at the first freeze-drying phase; 20 , 10h at the second freeze-drying phase. The ratio of protectants was the main affecting factor to the protective effect. Both the ratio of protectants and the time of the first freeze-drying phase were the main affecting factors to the stable effect. Amplified manufacture could be on the base of the freeze-drying curve.
Ultrafiltrated GEIF and freeze-dried GEIF were compared by ultra-violet scan and HPLC. Both of them had the maximum absorb wavelength around 250 1nm, the absorb
value<1.5; The HPLC fingerprint of ultrafiltrated GEIF was consistent with that of freeze-dried GEIF. Ret time and relative peak area of the both HPLC fingerprints did not achieved the level of significance (P>0.05). The main ingredients of ultrafiltrated GEIF were not changed by addition of the protectants and lyophilization. The choice of protectants conformed with the theoretic and practical principles. The added excipients did not affect the detections of ultra-violet scan and HPLC of freeze-dried GEIF.
Stored at 4 , 20 , 37 for 30d, freeze-dried GEIF was less sensitive to temperature than ultrafiltrated GEIF was. Both of them could keep activity at 4 after 30d;Stored at 20 for 30d, the activity of ultrafiltrated GEIF was worse than that of freeze-dried GEIF; At 37 for 30d, the activity of freeze-dried GEIF was better than that of ultrafiltrated GEIF and the distinction achieved extremely remarkable level(P<0.01). Ultrafiltrated GEIF should store at 2~8 .
After storage at RH 90% 5% and RH 75% 5% for 30d, we concluded: freeze-dried GEIF easily absorbed water because of it 's polyporous and rarefaction structure, which caused to lose the good appearance and activity. Freeze-dried GEIF was used qualified package material and packaged well, which could decrease the influence of relative humidity during transport and storage.
Primary studies on the stability of freeze-dried GEIF indicated: addition of the protectants and vacuum freeze-drying technology could improve the stability of ultrafiltrated GEIF to some extent.
本文利用添加保护剂和真空冷冻干燥技术，将GEIF超滤液(分子量＜3000道尔顿)制成冻干GEIF，以期增加产品稳定性、提高质量、延长货架期，并在一定程度上解决贮存和运输条件较为严格的问题，使产品利于质量控制。本试验筛选了最优冻干配方和冻干工艺参数，并将冻干GEIF与GEIF超滤液比较分析，进而对冻干GEIF的稳定性作了初步研究。本试验研究为冻干羊胎免疫调节因子保健品的研发提供了一定的实验依据，也可为相关的以多肽类为功效成分的保健食品的研发提供一定参考。试验结果表明：
1．甘露醇、蔗糖均可赋予冻干GEIF一定的外观性状，但因各自理化性质的不同，使得冻干GEIF的外观性状存在差异，主要表现为粗糙度不同。
2．甘露醇、蔗糖对GEIF的免疫活性具有不同冻干保护作用和贮存稳定性作用。作为缓冲剂的柠檬酸钠表现出相对较差的稳定性作用。从冻干保护效果和冻干稳定性效果综合考虑，选取4％(g／ml)甘露醇配比1％(g／ml)蔗糖的配方为最优配方。
3．以外观性状、免疫活性、水分含量为主要指标，从冻干和稳定效果考察，通过正交试验选得真空冷冻干燥的最佳工艺参数为第一阶段干燥温度-10℃、干燥时间25h；第二阶段干燥温度20℃、干燥时间10h。保护剂的配比为影响冻干效果的主要因素，对稳定效果则保护剂的配比和第一阶段干燥时间同为主要因素。根据最优组合得到的冻干曲线可作为放大生产的有效参考。
4．用紫外扫描和高效液相色谱对GEIF超滤液和冻干GEIF进行分析比较。两者的最大紫外吸收波长为250±1nm，紫外吸收峰值＜1.5；GEIF超滤液和冻干GEIF均分离出20个峰，两者图谱的相对峰面积在2％以上的峰，其保留时间和各组分相对百分含量这两个特征指标无显著性差异(P＞0.05)，图谱有相当好的吻合性。这初步表明GEIF超滤液经添加保护剂和真空冷冻干燥后，其主要成分没有发生显著性改变，保护剂的选择在理论和实际上均符合原则，添加的保护剂不影响冻干GEIF质量标准
冻于羊胎免疫调节因子及其稳定性初步研究
中紫外扫描和色谱指标的检测。
5．在4’C、20’C、37C下，经30天留样考察，GEIF超滤液受温度影响较大，而
冻干GEIF受温度影响较小。4℃、30天，两者均能保持良好活性；20℃、30天，GEIF
超滤液的免疫活性较冻干GEIF有所降低；37oC、30天，冻干GEIF的免疫活性极显
著高于GE F超滤液的免疫活性0功＊人＊mF超滤液应在2～8℃保存。
6．在相对湿度900土50和75O土50下，经30天留样考察，冻干GEIF因其特有
的多孔疏松结构极易吸潮，导致外观性状的改变和活性的丧失。若采用优质包村并包
装良好，可明显减轻在贮存和运输中环境相对湿度对产品的影响。
7．对冻干GEIF稳定性的初步研究表明，添加保护剂和采用真空冷冻干燥能在一
定程度上提高GEIF的稳定性。
Goat embryo immunoregulatory factor (GEIF) was the biological product developed from goat embryo with the ultrafiltration. In this paper, ultrafiltrated GEIF(molecular weight<3000dalton) was transformed into freeze-dried GEIF using vacuum freeze-drying technology and adding protectants or excipients. Freeze-dying formulation and parameters were optimized. Comparisons of ultrafiltrated GEIF and freeze-dried GEIF, stability of freeze-dried GEIF had also been studied. The results indicated:
Mannitol and sucrose could give the appearance to freeze-dried GEIF. The appearance of freeze-dried GEIF varied with the different physical and chemical characters of the protectants. The main difference was shown by the degree of crystalline particles and coarseness.
The immunoregulation activity of ultrafiltrated GEIF could be protected by mannitol and sucrose during vacuum freeze-drying. But the effects of each formulation were different. As buffer, sodium citrate did not bring about satisfied stable effect. Considered with the effect of protection and stabilization, 4%(g/ml) mannitol plus 1%(g/ml)sucrose was selected as the optimal formulation.
According to the cake appearance , immunoregulation activity and moisture content, the best vacuum freeze-drying parameters were -10 , 25h at the first freeze-drying phase; 20 , 10h at the second freeze-drying phase. The ratio of protectants was the main affecting factor to the protective effect. Both the ratio of protectants and the time of the first freeze-drying phase were the main affecting factors to the stable effect. Amplified manufacture could be on the base of the freeze-drying curve.
Ultrafiltrated GEIF and freeze-dried GEIF were compared by ultra-violet scan and HPLC. Both of them had the maximum absorb wavelength around 250 1nm, the absorb
value<1.5; The HPLC fingerprint of ultrafiltrated GEIF was consistent with that of freeze-dried GEIF. Ret time and relative peak area of the both HPLC fingerprints did not achieved the level of significance (P>0.05). The main ingredients of ultrafiltrated GEIF were not changed by addition of the protectants and lyophilization. The choice of protectants conformed with the theoretic and practical principles. The added excipients did not affect the detections of ultra-violet scan and HPLC of freeze-dried GEIF.
Stored at 4 , 20 , 37 for 30d, freeze-dried GEIF was less sensitive to temperature than ultrafiltrated GEIF was. Both of them could keep activity at 4 after 30d;Stored at 20 for 30d, the activity of ultrafiltrated GEIF was worse than that of freeze-dried GEIF; At 37 for 30d, the activity of freeze-dried GEIF was better than that of ultrafiltrated GEIF and the distinction achieved extremely remarkable level(P<0.01). Ultrafiltrated GEIF should store at 2~8 .
After storage at RH 90% 5% and RH 75% 5% for 30d, we concluded: freeze-dried GEIF easily absorbed water because of it 's polyporous and rarefaction structure, which caused to lose the good appearance and activity. Freeze-dried GEIF was used qualified package material and packaged well, which could decrease the influence of relative humidity during transport and storage.
Primary studies on the stability of freeze-dried GEIF indicated: addition of the protectants and vacuum freeze-drying technology could improve the stability of ultrafiltrated GEIF to some extent.
引文
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