DSX及其成分对体外培养鼠视网膜神经节细胞影响的实验研究
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摘要
目的:1 建立高压体外培养视网膜神经节细胞模型并观察压力对视网膜神经节细胞的影响；2初步探讨利用体外培养细胞系进行药物成分筛选的顺序；3 观察通瘀开窍中药灯盏细辛提取物(DSX)及其成分对体外培养视网膜神经节细胞的影响。
方法：1 建立大鼠视网膜神经细胞(Retinal Nerve Cells，RNCs)混合培养和视网膜神经节细胞(Retinal Ganglion Cells，RGCs)纯化培养模型。2 将装有RGCs的培养瓶密闭，分别加压至20mmHg、40mmHg、60mmHg、80mmHg，加压时间1～4小时后收集细胞，用流式细胞仪(FCM)测定凋亡细胞百分率。3在混合培养和纯化培养24小时后的神经细胞或RGCs中加入不同浓度的DSX及其成分DSX1-7、神经生长因子(NGF)、硼酸缓冲液，继续培养24小时，用噻唑兰比色法(MTT法)，测定每组的光密度值(OD值)。4在培养纯化的RGCs中加入DSX7，并密闭加压至80mmHg，4小时后收集细胞，用流式细胞仪测定凋亡细胞百分率。
结果：1 RNCs的混合培养最长可存活2～3周，RGCs的纯化培养可存活时间2～3天。2 压力20mmHg、40mmHg、60mmHg、80mmHg，加压时间1～4小时均能促进RGCS的凋亡，其凋亡细胞的数目以80mmHg、4小时为最多(P＜0.01)。3(1)在RNCs培养中，5mg／ml、0.5mg／ml、0.05mg／ml、0.005mg／ml浓度的DSX和神经生长因子的OD值高于空白对照组(P＜0.01)。(2)在RNCs培养中，10mg／ml的DSX3组的OD值低于空白对照组(P＜0.01)；2mg／ml、1mg／ml、0.2mg／ml、0.1mg／ml、0.02mg／ml、0.01mg／ml浓度的DSX3和神经生长因子组的OD值高于空白对照组(P＜0.05～0.01)。(3)在RNCs培养中，2mg／ml、1mg／ml、0.2mg／ml、0.1mg／ml浓度的DSX7的OD值高于空白对
照组(p<0.05一0.01)。(4)在RGCs培养中，Zmg/ml、zmg/ml浓度的DSX3的
oD值高于空白对照组(p<0.05)。Zmg/ml、lmg/ml、0.2mg/ml浓度的DsX7
的oD值高于空白对照组(P<0.05一0.01)。4在RGCs以80 mmHg培养4小时
时，浓度lmg/ml的DSX7组的凋亡百分率低于空白对照组和模型组P<0 .01)。
结论:l混合培养的RNCs比纯化培养的RGCs存活时间长。2压力能促
进RGCs的凋亡，其凋亡细胞的数目随压力的增大、时间的延长而增加。3 DSX7
是具有RGCs保护作用的最有效成分。4利用体外培养细胞系进行中药有效成
分的逐级筛选是有效而经济的方法之一。
PURPOSE: 1 To build high pressure cell culture model in vitro of Retinal Ganglion Cells(RGCs) and observe the RGCs effected by pressure . 2 To research the sequence of screening of Chinese medicine component with cell line in vitro. 3 To study the effect and mechanism of DSX and DSX1-7 for RGCs cultured in vitro.
METHODS: 1 Using one to three day SD-rats, we build Rat Retinal cells and RGCs cultured in virto.2 Put the different pressure (20mmHg, 40mmHg, 60mmHg, 80mmHg) to RGCs in close tightly culture-bottle for one to four hours, then collect RGCs and check the sum of apoptosis cells by Flow Cytometry(FCM). 3 Put different concentration DSX and DSX1-7, Nerve growth factor(NGF) and Boric acid Buffer in Retinal Nerve Cells (RNCs) and RGCs cultured after 24 hour in virto, then test the OD of living cells by MTT after anther 24 hours. (4) After cultured with the pressure of 80mmHg four hours, RGCs were collected and check the sum of apoptosis cells by Flow Cytometry.
RESULTS: 1 RNCs can survive two or three weeks, RGCs can survive two or three days. 2 The pressure of 20mmHg, 40mmHg, 60mmHg and 80mmHg for one or four hours can acceleration the apoptosis of RGCs, but the apoptosis in the pressure of SOmmHg for four hours was the most severe in all. 3 (1) To RNCs , The ODs of living cells in NGF and DSX whose concentration was 5mg/ml , 0.5mg/ml, 0.05mg/ml and 0.005mg/ml are higher than control's (P<0.05). (2) To RNCs, The OD of living cells in DSX3 whose concentration was 10mg/ml is lower than control's (P<0.01). The ODs of living cells in NGF and DSX3 whose concentration was 2mg/ml, Img/ml, 0.2mg/ml and 0.1mg/ml, 0.02mg/ml and 0.01mg/ml is higher than control's (P<0.05~0.01). (3). To RNCs, The ODs of
living cells in NGF and DSX7 whose concentration was 2mg/ml, Img/ml, 0.2mg/ml and O.lmg/ml are higher than contrors(P<0.05~0.01) .(4) To RGCs, The OD of living cells in DSX3 whose concentration was 2mg/ml and Img/ml are higher than control's(P<0.05) . The ODs of living cells in DSX7 which concentration was 2mg/ml, Img/ml and 0.2mg/ml are higher than control's (P<0.05~0.01).4 To RGCs with 80mg/ml for 4 hours , the percent of apoptosis of RGCs in DSX7 which concentration was Img/ml is lower than control's and model's (P<0.01).
CONCLUSIONS: 1 The surviving time of RNCs was longer than that of RGCs.2 Pressure can accelerate the apoptosis of RGCs. The more high pressure and the more long time, the sum of apoptosis of RGCs is more.3 DSX7 was the most effictive factor in Protecting RGCs in vitro.4 It was a effective and cheap method using cells cultured in vitro to search effective factor in Chinese medicine.
方法：1 建立大鼠视网膜神经细胞(Retinal Nerve Cells，RNCs)混合培养和视网膜神经节细胞(Retinal Ganglion Cells，RGCs)纯化培养模型。2 将装有RGCs的培养瓶密闭，分别加压至20mmHg、40mmHg、60mmHg、80mmHg，加压时间1～4小时后收集细胞，用流式细胞仪(FCM)测定凋亡细胞百分率。3在混合培养和纯化培养24小时后的神经细胞或RGCs中加入不同浓度的DSX及其成分DSX1-7、神经生长因子(NGF)、硼酸缓冲液，继续培养24小时，用噻唑兰比色法(MTT法)，测定每组的光密度值(OD值)。4在培养纯化的RGCs中加入DSX7，并密闭加压至80mmHg，4小时后收集细胞，用流式细胞仪测定凋亡细胞百分率。
结果：1 RNCs的混合培养最长可存活2～3周，RGCs的纯化培养可存活时间2～3天。2 压力20mmHg、40mmHg、60mmHg、80mmHg，加压时间1～4小时均能促进RGCS的凋亡，其凋亡细胞的数目以80mmHg、4小时为最多(P＜0.01)。3(1)在RNCs培养中，5mg／ml、0.5mg／ml、0.05mg／ml、0.005mg／ml浓度的DSX和神经生长因子的OD值高于空白对照组(P＜0.01)。(2)在RNCs培养中，10mg／ml的DSX3组的OD值低于空白对照组(P＜0.01)；2mg／ml、1mg／ml、0.2mg／ml、0.1mg／ml、0.02mg／ml、0.01mg／ml浓度的DSX3和神经生长因子组的OD值高于空白对照组(P＜0.05～0.01)。(3)在RNCs培养中，2mg／ml、1mg／ml、0.2mg／ml、0.1mg／ml浓度的DSX7的OD值高于空白对
照组(p<0.05一0.01)。(4)在RGCs培养中，Zmg/ml、zmg/ml浓度的DSX3的
oD值高于空白对照组(p<0.05)。Zmg/ml、lmg/ml、0.2mg/ml浓度的DsX7
的oD值高于空白对照组(P<0.05一0.01)。4在RGCs以80 mmHg培养4小时
时，浓度lmg/ml的DSX7组的凋亡百分率低于空白对照组和模型组P<0 .01)。
结论:l混合培养的RNCs比纯化培养的RGCs存活时间长。2压力能促
进RGCs的凋亡，其凋亡细胞的数目随压力的增大、时间的延长而增加。3 DSX7
是具有RGCs保护作用的最有效成分。4利用体外培养细胞系进行中药有效成
分的逐级筛选是有效而经济的方法之一。
PURPOSE: 1 To build high pressure cell culture model in vitro of Retinal Ganglion Cells(RGCs) and observe the RGCs effected by pressure . 2 To research the sequence of screening of Chinese medicine component with cell line in vitro. 3 To study the effect and mechanism of DSX and DSX1-7 for RGCs cultured in vitro.
METHODS: 1 Using one to three day SD-rats, we build Rat Retinal cells and RGCs cultured in virto.2 Put the different pressure (20mmHg, 40mmHg, 60mmHg, 80mmHg) to RGCs in close tightly culture-bottle for one to four hours, then collect RGCs and check the sum of apoptosis cells by Flow Cytometry(FCM). 3 Put different concentration DSX and DSX1-7, Nerve growth factor(NGF) and Boric acid Buffer in Retinal Nerve Cells (RNCs) and RGCs cultured after 24 hour in virto, then test the OD of living cells by MTT after anther 24 hours. (4) After cultured with the pressure of 80mmHg four hours, RGCs were collected and check the sum of apoptosis cells by Flow Cytometry.
RESULTS: 1 RNCs can survive two or three weeks, RGCs can survive two or three days. 2 The pressure of 20mmHg, 40mmHg, 60mmHg and 80mmHg for one or four hours can acceleration the apoptosis of RGCs, but the apoptosis in the pressure of SOmmHg for four hours was the most severe in all. 3 (1) To RNCs , The ODs of living cells in NGF and DSX whose concentration was 5mg/ml , 0.5mg/ml, 0.05mg/ml and 0.005mg/ml are higher than control's (P<0.05). (2) To RNCs, The OD of living cells in DSX3 whose concentration was 10mg/ml is lower than control's (P<0.01). The ODs of living cells in NGF and DSX3 whose concentration was 2mg/ml, Img/ml, 0.2mg/ml and 0.1mg/ml, 0.02mg/ml and 0.01mg/ml is higher than control's (P<0.05~0.01). (3). To RNCs, The ODs of
living cells in NGF and DSX7 whose concentration was 2mg/ml, Img/ml, 0.2mg/ml and O.lmg/ml are higher than contrors(P<0.05~0.01) .(4) To RGCs, The OD of living cells in DSX3 whose concentration was 2mg/ml and Img/ml are higher than control's(P<0.05) . The ODs of living cells in DSX7 which concentration was 2mg/ml, Img/ml and 0.2mg/ml are higher than control's (P<0.05~0.01).4 To RGCs with 80mg/ml for 4 hours , the percent of apoptosis of RGCs in DSX7 which concentration was Img/ml is lower than control's and model's (P<0.01).
CONCLUSIONS: 1 The surviving time of RNCs was longer than that of RGCs.2 Pressure can accelerate the apoptosis of RGCs. The more high pressure and the more long time, the sum of apoptosis of RGCs is more.3 DSX7 was the most effictive factor in Protecting RGCs in vitro.4 It was a effective and cheap method using cells cultured in vitro to search effective factor in Chinese medicine.
引文
1 严密主编．眼科学．北京：人民卫生出版社，1987：152
2 Robuct A, Schumer RA et al. The Nerve of Glaucoma. Arch ophthamol, 1994; 112: 37-44
3 何育生，姚景丽．神经保护剂在急性缺血中的应用(J)．国外医学脑血管疾病分册．1997；5(2)：104-107
4 祝枚东，蔡丰英．复方丹参注射液对慢性高眼压兔眼视神经轴浆流影响的研究(J)．中华眼科杂志，1991；27(3)：174
5 贾莉君，蒋幼芹，吴振中．青光康片对已控制的原发性晚期青光眼临床疗效观察(J)．实用眼科杂志，1994；12(5)：269
6 徐新荣，蔡丰英．葛根素对慢性高眼压兔眼视神经轴浆流影响的实验研究(J)．中国中医眼科杂志，1997；7(1)：3
7 彭清华，罗萍，李波，等．青光安颗粒对慢性高眼压兔眼眼内组织的保护作用(J)．中西医结合眼科杂志，1998；16(3)：129
8 钟一声等．吡喃葡萄糖甙对培养大鼠视网膜神经细胞的影响培养(J)．眼科新进展，1999；19(1)：5—7
9 贾莉君等．急性高眼压致大鼠视网膜神经节细胞细胞色素氧化酶活性降低(J)．眼科研究，1995：13(4)：228-231
10 张宗端，段俊国．优视胶囊对急性高眼压家兔眼压及神经节细胞的影响(J)．眼视光学杂志，2001：3(2)：99-102
11 王另芳，段俊国．优视胶囊对不同高眼压家兔模型视功能影响的实验研究．成都中医药大学2002届硕士研究生学位论文。
12 吴永青，葛坚，邱鹏新，等．视网膜神经节细胞体外培养、纯化及生物学特性研究(J)．中华眼科杂志，1999；35(3)：190
13 凌启波主编，实用病理特殊染色和组化技术(M)．广东教育出版社．第一版，1989 148—168
14 Quigley HA, Dunkelberger GR, Richard Green W. Retinal ganglion cell atrophy correlated
with automated perimetry in human eyes with glaucoma. Am J Ophthalmic, 1989; 107: 453
15 Quigley HA, Addicks EM, Richard Green W. Optic nerve damage in human glaucoma. Arch Ophthalmic, 1982; 100: 135
16 余敏斌，综述．原发性开角型青光眼治疗的进展和认识。国外医学眼科学分册，1994；18(5)：281
17 Nickells RW, Zack DJ. Apoptosis in ocular disease: a molecular overview. J Glaucoma, 1996; 5: 345
18 胡野，凌志强，单小云，编著．细胞凋亡的分子医学．北京：军事医学科学出版社，2002；7：14，128—129
19 Quigley HA, Robuct W, Kerrigan A, et al. Retinal Ganglion Cell Death in Experimemtal Glaucoma and After Axotomy Occurs by Apoptosis. Invest Ophthalmol Vis Sci, 1995; 36: 774-786
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21 Wax MB, Deepak E, et al. Clinical and Ocular Histopathological Findings in a patient With Normal-Pressur Glaucoma. Arch Ophthalmol, 1998; 116: 993-1001
22 Murakami A, Okisaka S. Nippo Ganka Gakkai Zasshi. 1998; 102: 645
23 Wax MB, Tezel G. Neurobiology ofglaucomatous optic neuropathy: diverse cellular events in neurodegeneration and neuroprotection. Mol Neurobiol 2002 Aug; 26(1): 45-55
25 Oku H et al. Surv Ophthalmol, 1996; 44(Suppl 1): S74
26 Osborne Net al. Surv Ophthalmol, 1999; 43(Suppl 1): S102
27 廖品正，主编．中医眼科学(第五版)．上海：上海科学技术出版社，1986：104
28 廖品正，主编．中医眼科学(全国高等中医统编函授教材)．长沙：湖南科学技术出版社，1976：30-31
29 金·刘完素．素问玄机原病式．第一版．北京：人民卫生出版社，1983：180
30 明·楼英．医学纲目．第一版．北京：人民卫生出版社．1987：430
31 清·傅仁宇．审视瑶函．第一版．沈阳：辽宁科学技术出版社，1997：15
32 Raft M, Field K, et al. Cell-type specific markers for distingnishing and studying neurons and the major classas of glialcell in culture. Brain Res, 1979; 174: 283—308
33 Sarthy PV, Curtis BM, Catterall WA. Retrograde labeling enrichment and characterization of retinal ganglion cells from the neonatal rat. J Neurosci, 1983; 3: 2532
34 Leifer D, lipton SA, Bamstable CJ, et al. Monoclonal antibody to Thy-1 enhances regeneration of processesby rat retinal ganglion cells in culture. Science, 1984; 224: 303-306
35 Montague PR, friedlander MJ. Morphogenesis and territorial coverage by isolated mammalian retinal ganglion cells. J Neurosci, 1991; 11: 1440-1457
36 Takahashi N. Cummmins D, Caprioli J. Rat rat retinal ganglion cells in culture. Exp Eye Res, 1991; 53: 565-572
37 周明华，赵丽萍．中脑顶盖提取液对培养在不同支持物的初生大鼠视网膜神经细胞生长的影响(J)．解剖学报，1991；22：195
88 赵丽萍，周明华．鸡胚前脑细胞在各种支持物特别是人羊膜基底膜上生长的定量研究(J)．解剖学报，1989；20：56
39 钟一声等．大鼠视网膜神经细胞的培养(J)．中华眼科杂志，1999；35(2)：137
40 谭曾鲁，周柔丽．医学细胞生物学(M)．北京医科大学，中国协和医科大学联合出版社，1992，258-261
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42 胡竹林，杜蜀华．压力对大鼠纯化视网膜神经节细胞诱导型一氧化氮和酶mRNA及其蛋白表达的影响．中华眼科杂志，2002；38(8)：495-498。
43 胡竹林，杜蜀华．L-精氨酸和左旋-硝基精氨酸甲酯对纯化视网膜神经节细胞凋亡的影响．中华眼科杂志．2002；18(2)：137-139
44 Takano, K et al. Pressure-induced apoptosis in human lymphoblasts. Exp Cell Res, 235: 155-60(1997)
45 明·楼英．医学纲目，第一版．北京：人民卫生出版社，1987：430
46 清·马云从．眼科阐微，第一版．南京：江苏科技出版社，1984：25
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52 佟爱华．云南灯盏花素治疗糖尿病周围神经病变30例(J)．时珍国医国药，1999：10(11)：863
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2 Robuct A, Schumer RA et al. The Nerve of Glaucoma. Arch ophthamol, 1994; 112: 37-44
3 何育生，姚景丽．神经保护剂在急性缺血中的应用(J)．国外医学脑血管疾病分册．1997；5(2)：104-107
4 祝枚东，蔡丰英．复方丹参注射液对慢性高眼压兔眼视神经轴浆流影响的研究(J)．中华眼科杂志，1991；27(3)：174
5 贾莉君，蒋幼芹，吴振中．青光康片对已控制的原发性晚期青光眼临床疗效观察(J)．实用眼科杂志，1994；12(5)：269
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11 王另芳，段俊国．优视胶囊对不同高眼压家兔模型视功能影响的实验研究．成都中医药大学2002届硕士研究生学位论文。
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21 Wax MB, Deepak E, et al. Clinical and Ocular Histopathological Findings in a patient With Normal-Pressur Glaucoma. Arch Ophthalmol, 1998; 116: 993-1001
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28 廖品正，主编．中医眼科学(全国高等中医统编函授教材)．长沙：湖南科学技术出版社，1976：30-31
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34 Leifer D, lipton SA, Bamstable CJ, et al. Monoclonal antibody to Thy-1 enhances regeneration of processesby rat retinal ganglion cells in culture. Science, 1984; 224: 303-306
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37 周明华，赵丽萍．中脑顶盖提取液对培养在不同支持物的初生大鼠视网膜神经细胞生长的影响(J)．解剖学报，1991；22：195
88 赵丽萍，周明华．鸡胚前脑细胞在各种支持物特别是人羊膜基底膜上生长的定量研究(J)．解剖学报，1989；20：56
39 钟一声等．大鼠视网膜神经细胞的培养(J)．中华眼科杂志，1999；35(2)：137
40 谭曾鲁，周柔丽．医学细胞生物学(M)．北京医科大学，中国协和医科大学联合出版社，1992，258-261
41 叶长华，蒋幼芹，江冰．白蒺藜醇甙对混合培养鼠视网膜神经节细胞的作用(J)．眼视光学杂志，2001；3(3)：148-151。
42 胡竹林，杜蜀华．压力对大鼠纯化视网膜神经节细胞诱导型一氧化氮和酶mRNA及其蛋白表达的影响．中华眼科杂志，2002；38(8)：495-498。
43 胡竹林，杜蜀华．L-精氨酸和左旋-硝基精氨酸甲酯对纯化视网膜神经节细胞凋亡的影响．中华眼科杂志．2002；18(2)：137-139
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