苦瓜性别分化相关分子标记的研究
摘要
苦瓜(Momordica charantia．L)是葫芦科苦瓜属的一年生蔓生植物，雌雄同株。苦瓜在全国广泛栽培，是一种重要的蔬菜，而且具有药用价值。
目前，分子标记被广泛应用于植物的亲缘关系分析、种质鉴定、遗传图谱构建、目标基因定位、辅助育种等各个方面，但在苦瓜方面的应用较少。本试验采用随机扩增多态性DNA(Random Amplified Polymorphism DNA，RAPD)技术和简单重复间序列标记(inter-simple sequence repeat，ISSR)技术，研究与苦瓜性别连锁的分子标记。研究结果如下：
1．用CTAB改良方法可以快速提取苦瓜基因组DNA，其浓度和纯度达到了RAPD和ISSR分子标记试验的要求。
2．优化苦瓜RAPD体系，从200条随机引物中筛选出8条可能与性别连锁的RAPD标记。利用全雌、强雌和强雄个体进行验证，发现引物S30所扩增的约550bp的谱带和S66所扩增的约450bp的谱带在所有的全雌性个体都出现，而在所有强雌和强雄个体中都不出现，初步表明这两条是与雌性紧密连锁的RAPD分子标记。
3．把RAPD雌性特异条带S30_(550)克隆转化为特异稳定的SCAR标记SR_(550)，说明S30_(550)与苦瓜雌性基因连锁。
4．利用ISSR技术进行苦瓜性别的研究，建立苦瓜ISSR-PCR反应体系，得到清晰的ISSR指纹图谱。
5．从100条ISSR引物中筛选出7条可能与性别连锁的ISSR标记。利用全雌、强雌和强雄个体进行验证，发现引物807所扩增的约400bp的谱带、809所扩增的约900bp的谱带和810扩增的约1400bp的谱带在所有的全雌性个体都出现，而在所有强雌和强雄个体中都不出现，初步表明这可能是三条与雌性紧密连锁的ISSR分子标记。
Bitter melon (Momordica charantia L.) is a member of Cucurbiteae and an herbaceous trailing annual capable of spreading in all directions. It is a monoecious plant that is cultivated around the country and East Asia for its immature fruits with highly medicinal value.
Molecular markers have been widely used in genetic relationship, genetic polymorphism , construction of genetic map , gene location, molecular markers assisted selection , and varieties identification in the vegetable researches and production, but there has been little research about bitter melon. This paper studied the molecular markers related to the sex differentiation of bitter melon with RAPD (Random Amplified Polymorphism DNA) and ISSR (inter-simple sequence repeat).The main results were as following:
1. The genomic DNA of bitter melon with high concentration and purity could be obtained with the improved method of CTAB, which was good enough for RAPD and ISSR amplification. And the genomic DNA can be completely digested.
2.RAPD markers linked to sex were selected by screening 200 primers. The marker amplified by S30 and S66 were present in all female individuals while absent from all male individuals. It showed that it was a marker closely linked to sex. This work will do great help on cloning sex-linked gene.
3. Based on the S30_(550) sequence, a pair of primer P1 and P2 was designed, the marker of RAPD-S30_(550) was successfully converted into SCAR marker SR_(550). The result showed that S30_(550) was a female marker linked to sex.
4. Study molecular markers linked to sex differentiation in bitter melon, we set up the system of ISSR-PCR.
5. ISSR markers linked to sex were selected by screening 100 primers. The marker amplified by 807-400bp, 809-900bp and 810-1400bp were present in all female individuals while absent from all male individuals. It showed that there were three female markers closely linked to sex. This work will do great help on cloning sex-linked gene.
目前，分子标记被广泛应用于植物的亲缘关系分析、种质鉴定、遗传图谱构建、目标基因定位、辅助育种等各个方面，但在苦瓜方面的应用较少。本试验采用随机扩增多态性DNA(Random Amplified Polymorphism DNA，RAPD)技术和简单重复间序列标记(inter-simple sequence repeat，ISSR)技术，研究与苦瓜性别连锁的分子标记。研究结果如下：
1．用CTAB改良方法可以快速提取苦瓜基因组DNA，其浓度和纯度达到了RAPD和ISSR分子标记试验的要求。
2．优化苦瓜RAPD体系，从200条随机引物中筛选出8条可能与性别连锁的RAPD标记。利用全雌、强雌和强雄个体进行验证，发现引物S30所扩增的约550bp的谱带和S66所扩增的约450bp的谱带在所有的全雌性个体都出现，而在所有强雌和强雄个体中都不出现，初步表明这两条是与雌性紧密连锁的RAPD分子标记。
3．把RAPD雌性特异条带S30_(550)克隆转化为特异稳定的SCAR标记SR_(550)，说明S30_(550)与苦瓜雌性基因连锁。
4．利用ISSR技术进行苦瓜性别的研究，建立苦瓜ISSR-PCR反应体系，得到清晰的ISSR指纹图谱。
5．从100条ISSR引物中筛选出7条可能与性别连锁的ISSR标记。利用全雌、强雌和强雄个体进行验证，发现引物807所扩增的约400bp的谱带、809所扩增的约900bp的谱带和810扩增的约1400bp的谱带在所有的全雌性个体都出现，而在所有强雌和强雄个体中都不出现，初步表明这可能是三条与雌性紧密连锁的ISSR分子标记。
Bitter melon (Momordica charantia L.) is a member of Cucurbiteae and an herbaceous trailing annual capable of spreading in all directions. It is a monoecious plant that is cultivated around the country and East Asia for its immature fruits with highly medicinal value.
Molecular markers have been widely used in genetic relationship, genetic polymorphism , construction of genetic map , gene location, molecular markers assisted selection , and varieties identification in the vegetable researches and production, but there has been little research about bitter melon. This paper studied the molecular markers related to the sex differentiation of bitter melon with RAPD (Random Amplified Polymorphism DNA) and ISSR (inter-simple sequence repeat).The main results were as following:
1. The genomic DNA of bitter melon with high concentration and purity could be obtained with the improved method of CTAB, which was good enough for RAPD and ISSR amplification. And the genomic DNA can be completely digested.
2.RAPD markers linked to sex were selected by screening 200 primers. The marker amplified by S30 and S66 were present in all female individuals while absent from all male individuals. It showed that it was a marker closely linked to sex. This work will do great help on cloning sex-linked gene.
3. Based on the S30_(550) sequence, a pair of primer P1 and P2 was designed, the marker of RAPD-S30_(550) was successfully converted into SCAR marker SR_(550). The result showed that S30_(550) was a female marker linked to sex.
4. Study molecular markers linked to sex differentiation in bitter melon, we set up the system of ISSR-PCR.
5. ISSR markers linked to sex were selected by screening 100 primers. The marker amplified by 807-400bp, 809-900bp and 810-1400bp were present in all female individuals while absent from all male individuals. It showed that there were three female markers closely linked to sex. This work will do great help on cloning sex-linked gene.
引文
[1] 邓俭英，张玲玲，方锋学等．园艺植物性别鉴定的研究概述[J]．长江蔬菜，2005(12)：31～33
[2] 汪俏梅，曾广文，将有条．苦瓜性别表现研究概况及展望[J]．中国蔬菜，1995，4：50～53
[3] Laibach F.uber sommer and winterannuelle rasse von Arabidopsis thaliana (l.) Heynh. Ein Beitrag Zur Atiologie der Blutenbildung[J]. Beitr Bid Pflanz,1951,28:173～210
[4] 汪俏梅．苦瓜四季丰产栽培[M]．北京：科学技术出版社．2001，16(1)：45～46
[5] Prakash G. Effect if photoperiod a-NAA and MH on sex expression and sex-ratio in bitter-gourd (Momordica charantia L.) [J]. plant science, 1974,6:97～99
[6] 汪俏梅，曾广文，蒋有条．温度和光周期对苦瓜性别表现的影响[J]．中国蔬菜，1997(1)：1～4
[7] Page T, Macknight R, Yang C H, et al. Genetic interactions of the Arabidopsis flowering time gene FCA. with genes regulating floral initiation[J]. Plant,1999,17:231～239.
[8] 刘波，郑国生，闫志佩，王宗正．低温处理对牡丹春节催花及营养类物质变化的影响[J]．西北植物学报，2004，24(9)：1635-1639
[9] 张志炎，刘长庆，孙发仁．春化条件对大白菜花芽分化及种株发育的影响[J]．中国蔬菜，1995(5)：35-36
[10] 李兴军，李三玉，汪国云等．杨梅花芽孕育期间叶片酸性蔗糖酶活性及糖类含量的变化[J]．四川农业大学学报，2000，18(2)：164～166
[11] 汪俏梅，曾广文．苦瓜性别分化的形态与组织化学研究[J]．浙江农业大学学报，1997，23(2)：149～153
[12] Buban T, Faust M.Flower bud induction in apple tree:Internal Control Differentiation[J]. Hort.Rev,1982,4:174
[13] Faust M. Physiology of temperate zone fruit trees[M]. New York:John Wiley and Sons,1989
[14] 黄海．关于果树花芽分化的研究[J]．果树科学，1987，4(3)：41～47
[15] 张万萍，史继孔．银杏雄花芽分化期间内源激素、碳水化合物和矿质营养含量的变化[J]．林业科学，2004，40(2)：51～54
[16] Corbesier L, Lejiune P, Bernier G. The role of carbohydrates in the induction of flowering in Arabidopsis thaIiana: comparison between the wild type and a starchless mutant[J]. Planta,1998,206 (1): 131～137
[17] 邓俭英，张玲玲，张曼等．苦瓜花芽不同分化期的形态及糖含量研究[J]．广西农业科学，2007，37(4)：422～425
[18] 方得秋，肖顺元，章文才．柑桔同工酶组织器官特异性研究[J]．浙江柑橘，1991，4：4～6
[19] 应振土，李曙轩．瓠瓜与黄瓜的性别表现和内源乙烯与氧化酶活性的关系[J]．园艺学报，1990，(1)：51～57
[20] 艾辛，祝莉莉，舒理慧等．黄瓜植株性别表现与3种氧化酶同工酶的关系[J]．武汉植物学研究，2000，18(3)：184～188
[21] 张玲玲．苦瓜性别分化的形态学及生理基础研究(硕士学位论文)[D]．南宁：广西大学，2006：17～20
[22] 汪俏梅，曾广文．苦瓜性别分化的特异蛋白质研究[J]．植物学报，1998，40(3)：241～246
[23] 龙程，潘瑞炽．雌雄石刁柏嫩茎的蛋白质含量何超氧物歧化酶活性研究[J]．园艺学报，1992，19(4)：373～374
[24] 郭金丽，张玉兰．苹果梨花芽分化期蛋白质、淀粉代谢的研究[J]．内蒙古农牧学院学报，1999，20(2)：80～82
[25] 李曙轩．乙烯利及赤霉素对瓠瓜性别的影响[J]．植物生理学报，1981，7(3)：265
[26] Ursin VN, Yamaguchi J, Mecormick S. Gametophytic and sporophytic expression of anther-specific genes in development tomato anthers[J].Plant cell, 1989,1:727
[27] 汪俏梅，曾广文．激素和多胺对苦瓜性别分化的影响[J]．园艺学报，1997，24(1)：48～52
[28] Meyerowitz EM. The genetics of flower development[J], scientific America, 1994, 27(5):40
[29] Tassoni A, Van Buren M.Franceschetti M.Fornale S,BagniN.Polyamine content and metabolism in Arabidopsis thaliana and effect of spermideine on plant development[J].Plant Physiol Biochem, 2000,38(5):383～393
[30] Dellaporta S L, Calderon-Urrea A. Sex determination in flowering plants[J]. Plant Cell, 1993,5(10):1241～1251
[31] Trebitsh J,Staub J E, Onell S D. Identification of a 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid synthasegene linked to the female(F) locus that enhances female sex expression in cucumber[J]. Plant Physiol,1997,113:987～995
[32] Perl-Treves R,Kahana A,Rosenman N,et al.Expression of multiple AGAMOUS-like genes in male and female flowers of cucumber(Cucumis sativus L.) [J]. Plant CellPhysiol, 1998,39(7): 701～710
[33] 杨满业，赵茂俊，徐莺，唐琳，白洁，陈放．苦瓜MADS盒基因的克隆和表达研究[J]．北京林业大学学报，2004，26(4)：30～35
[34] 陈中海．番木瓜性别的生化标记和分子标记研究(硕士学位论文)[D]．福州：福建农林大学，2001：22
[35] 徐玉波．黄瓜性别分化相关的遗传标记研究(硕士学位论文)[D]．南京：南京农业大学，2004：57～66
[36] 韦第．罗汉果性别的分子标记研究(硕士学位论文)[D]．南宁：广西大学，2005：18～30
[37] 张潞生．猕猴桃雌雄性别AFLP和RAPD标记(博士学位论文)[D]．北京：中国农业大学，2000：40～56
[38] 周玉亮．分子标记技术及其在植物遗传育种中的应用[J]．生物技术通讯，2005，5：350～352
[39] 周延清．DNA分子标记技术在植物研究中的应用[M]．化学工业出版社，2005，5：3～4
[40] 邢少辰，蔡玉红，尹会兰．遗传标记的发展及应用[J]．邯郸农业高等专科学校学报，2000，17(2)：2
[41] Williams JGK, Kubelik AR, Livak KJ, et al. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers areuseful as genetic markers[J]. Nucleic Acids Res, 1990, 18 (22): 6531～6535.
[42] Welsh J, Mc Clelland M. Fingerp rinting genomesusing PCR with arbitrary primers[J]. Nucleic Acids Res, 1990, 18(24): 7213～7218.
[43] rnheim N, Erlich H. Polymerase chain reaction strategy[J]. Annu Rev Biochem, 1992, 61: 131～156
[44] 惠东威，陈受宜．RAPD技术及其原理[J]．生物工程进展，1992，12(6)：1～5
[45] 贾继增．分子标记种质资源鉴定和分子标记育种[J]．中国农业科学，1996，29 (4): 1～10
[46] PillayM, Kenny ST. Anomalies of direct pairwise comparison of RAPD fragment for genetic analysis [J]. BioTechniques, 1995,19: 694～698
[47] Paran I, Kesseli R,Michelmore R. Development of reliable PCR -based markers linked to downy mildew resistance genes in lettuce[J]. TheorApplgenet,1993,85:985～993
[48] T.Debener, T.Janakiram and L.Mattiesch. Sports and seedlings of rose varieties analysed with molecular markers[J]. Plant Breeding, 2000, 119:71-74.
[49] Moreno S, Martin J.P., and Ortiz J.M.. Inter-simple sequence repeats PCR for characterization of closely related grape vinegermplasm[J]. Euphytica.1998, 101:117～125.
[50] Zietkiewicz E, Rahh A, Labuda D. Genome fingerprinting by simple sequence repeat (SSR) -anchored polymerase chain reaction amplification[J].genomics.1994,20:176～183
[51] Gupta M,ChylY S,Romero—Seven, son J,Owen JL.Ampiification of DNA marker from evolutionarily diverse genomesusing simple primers of simple-flequence repeats[J].Theor Appl Genet.1994,89:998～1006
[52] 高慧敏，张颖君，宋炳彦，梁玉芹．分子标记在蔬菜种质资源和育种上的应用[J]．河北农业科学，2005，6(2)：78～81
[53] RoderM. S., KorzunV., WendehakeK, PlaschkeJ., TixierMH, LeroyP., and Ganal M.W. A microsatellite map of wheat[J].Genetics. 1998,149(4):2007～2023
[54] 邓俭英，刘忠，康德贤，方锋学．RAPD分子标记技术在蔬菜研究中的应用[J]．种子，2005，3：39～42
[55] Blair M.W, Panaud O., and M Couch S.R. Inter-simple sequence repeat (ISSR) amplification for analysis of microsatellite motif sequence and fingerprinting in rice (Oryza sativa L),Theor. Appl[J]. Genet., 1999,98:780～792
[56] 胡学军，邱正明．RAPD分子标记技术及其在十字花科蔬菜研究中的应用[J]．湖北农业科学，2005，3：107～110
[57] 孙妮，胡开林，张长远．RAPD技术鉴定苦瓜杂种一代的研究[J]．广东农业科学，2005，1：40～42
[58] 张菊平．RAPD技术在苦瓜、辣椒一代杂种种子纯度鉴定上的应用研究[D]．硕士学位论文，2003：26～29
[59] Wolfe AD,Xiang QY, Kephart SR1.Diploid hybrid speciation in Penstemon (Scrophulariaceae) [J]. Proc Natl Acad SciuSA ,1998, 95: 5112～5115.
[60] 秦莲花，宋春艳，谭琦，陈明杰，潘迎捷．用ITS和ISSR分子标记技术鉴别香菇生产用种[J]．菌类学报，2006，25(1)：94～100
[61] 王建波．ISSR分子标记及其在植物遗传学研究中的应用[J]．遗传，2002，24(5)：613～616
[62] 孙洪，程静，詹克慧，张相武，杨艳会．ISSR标记技术及其在作物遗传育种中的应用[J]．分子植物育种，2005，3(1)：123～127
[63] 张长远，孙妮，胡开林．苦瓜品种亲缘关系的RAPD分析[J]．分子植物育种，2005，3(4)：515～519
[64] 刘万勃，宋明，刘富中．RAPD和ISSR标记对甜瓜种遗传多样性的研究[J]．农业生物技术学报，2002，10(3)：231～236
[65] Eiadthong W, Yonemori K, Sugiura A., et al. Identification of mango cuhivars of Thailand and evaluation of their genetic variationusing the amplified fragments by simple sequence repeat (SSR) anchored primers[J]. Sci Hor,1999,82:57～66
[66] Lanham PG, Korycinska A, Brennan RM. Genetic diversity within a secondary gene pool for Ribes nigrum L.revealed by RAPD and ISSR markers[J]. Holt. Sci. Biotch,2000,75(4): 371～375.
[67] Moreno S, Martin JP, Ortiz JM.. Inter-simple sequence repeats PCR for characterization of closely related grapevine germplasm[J]. Euphytica,1998,117～125
[68] 杨若林，孔俊，吴鑫，邓志瑞，陈沁，刘文轩．ISSR标记在辣椒资源遗传多态性分析中的初步应用[J]．上海大学学报：自然科学版，2005，11(4)：423～426，435
[69] 张仁兵，易克，许勇．用重组自交系构建西瓜分子遗传图谱[J]．分子植物育种，2003，1(4)：481～489
[70] 易克，徐向利，卢向阳，许勇，肖浪涛，王永健，康国斌．利用SSR和ISSR标记技术构建西瓜分子遗传图谱[J]．湖南农业大学学报：自然科学版，2003，29(4)：333～337
[71] 陈劲枫，娄群峰，余纪柱，庄飞云．黄瓜性别基因连锁的分子标记筛选[J]．上海农业学报，2003，19(4)：11～14
[72] 许勇，欧阳新星，张海英等．与西瓜野生种质抗枯萎病基因连锁的RAPD标记[J]．植物学报，1999，41(9)：952～955．
[73] 盖树鹏，孟翔栋．大葱胞质雄性不育基因的RAPD标记[J]．农业生物技术学报，2002，10(1)：94～97．
[74] Martin GB., Williams JGK, Tanksley SD. Identification of markers linked to disease2resistance genes by bulked segregation analysis: Arapidmethod to detectmarkers in specific genomic regionsbyusing segregation population[J]. Proc NatlAcad SciUSA, 1991, 88:9828～9832
[75] 吴旭红．甜菜抗丛根病基因(Rz1)ISSR分子标记的初步研究[J]．中国糖料，2005，2：9～11
[76] 吴旭红．甜菜抗根腐病基因ISSR分子标记的初步研究[J]．齐齐哈尔大学学报，2005，6(2)：30～32
[77] 曹必好，宋洪元，雷建军等．结球甘蓝抗TuMV相关基因的克隆[J]．遗传学报，2002，29(7)：646～652
[78] 盖树鹏，孟祥栋．利用RAPD技术进行植物性状标记及辅助选择[J]．生物技术通报．1999．6：33～37
[79] Serquen FC,Bacher J,and Staub JE.Mapping and QTL, analysis of horticultural traits in a narrow cross in cucumber(Cucumis Stivis L.)using random amplified polymorphic DNA marker[J]. Mmolecular. Breeding,1997,3:257～268
[80] Yu YG, Saghai MA, Buss GR1 Divergenceand allelomorphic relationshipofa soybean virusresistance gene based of tightly linked DNA microsatellite and RFLP markers[J]. Theor Appl Genet ,1996,92:642～691
[81] Michelmore R W, Paran I, Kesseli R V. Identification of markers linked to disease-resistance genes by bulked segregant analysis: A rapid method to detect markers in specific genomic regions byusing segregatingpopulations[J]. Proc Natl Acad SciuSA, 1991,88:9823～9832.
[82] 王得元，邓义才，李乃坚．RAPD标记检测蔬菜种子纯度中DNA提取方法研究[J]．广东农业科学，1999(3)：13～14
[83] 傅荣昭，孙勇昭，贾士荣．植物遗传转化技术手册[M]．北京：中国科学技术出版社，1994．131～137
[84] 王关林，方宏筠．植物基因工程原理与技术[M]．北京：科学出版社，1998：598～602
[85] 奥斯伯，金斯顿，塞德曼等．精编分子生物学实验指南[M]．北京：科学出版社，2005
[86] 萨姆布鲁克(Sambrook，J)，金冬雁等．分子克隆实验指南[M]．北京：科学出版社，2002
[87] 向太和，王利琳，胡江琴，庞基良，余爱华．不同性别类型黄瓜品种基因组DNA的提取及RAPD标记的初步研究[J]．杭州师范学院学报(自然科学版)，2005，3(2)：121～124
[88] 娄群峰，陈劲枫，Molly Jahn，陈龙正，耿红，罗向东．黄瓜全雌性基因连锁的AFLP和SCAR分子标记[J]．园艺学报，2005，32(2)：256～261
[89] Mandolino G, CarboniA, Forapani S, FaetiV, Ranalli P. Identification of DNA markers linked to themale sex in dioecious hemp (Cannabis sativa L.) [J]. Theor Appl Genet.1999, 9(1): 86～92.
[90] 马尼阿蒂斯(Maniatis，T．)．分子克隆实验手册[M]．杭州：浙江科学技术出版社，1987
[91] 何正文，刘运生，陈立华等．正交设计直观分析法优化PCR条件[J]．湖南医科大学学报，1998，23(4)：403～404
[92] 谢运海，夏德安，姜静等．．利用正交设计优化水曲柳ISSR—PCR反应体系[J]．分子植物育种，2005，3(3)：445～450
[93] 刘海河，侯喜林，张彦萍．西瓜ISSR-PCR体系的正交优化研究[J]．果树学报，2004，21(6)：615～617
[94] 林萍，张含国，谢运海．正交设计优化落叶松ISSR-PCR反应体系[J]．生物技术，2005，15(5)：34～37
[95] 邹喻苹，葛颂，王晓东．系统与进化植物学中的分子标记[M]．北京：科学出版社，2001
[96] 宣继平，章镇．适合于苹果ISSR反应体系的建立[J]．植物生理学通讯，2002，38(6)：549～550
[97] 乔玉山，章镇，房经贵等．李种质资源ISSR反应体系的建立[J]．果树学报，2002，20(4)：270～274
[98] 余艳，陈海山，葛学军．简单重复序列区间(ISSR)引物反应条件优化与筛选[J]．热带亚热带植物学报，2003，11(1)：15～19
[99] 张今今，王跃进．苹果PAPD反应体系的研究[J]．西北农业大学学报，2000，28(5)：6559
[100] 王得元，张长远等．辣椒RAPD反应体系研究[J]．广东农业科学，2001，(1)：21～22
[101] 曾莉娟，郑成木．硅胶干燥旱稻叶片制备DNA样品及其RAPD反应体系的建立[J]．热带农业科学，2002，22(5)：9～12
[102] 蒋曹德，邓昌彦．随机扩增多态DNA规范化反应技系探讨[J]．生物技术通报，2002，158(3)：40～43
[103] Michelmore R W.Identification of marker linked to disease resistance gene by bulked segregant analysis:A rapid method detect marker in specific genomic regions byusing segregating populations[J]. Proc Nat Acad SciuSA,1991,88:9828～9832.
[104] 陈其军，韩玉珍，傅永福等．大麻性别的RAPD和SCAR分子标记[J]．植物生理学报，2001，27(2)：173～178
[105] 李兴国，李全梓，张宪省．黄瓜性别决定的细胞学研究[J]．山东农业大学学报(自然科学版)，2001，32(4)：411～417
[106] Reamon Buttner SM, SchondelmaierJ, Jung C. AFLPmarkers tightly linked to the sex locus in Asparagus officinalisL[J]. MolecularBreeding, 1998, 4 (2):91～98.
[107] 宋文芹，刘松，李秀兰，陈瑞阳．利用AFLP技术筛选与银杏性别相关的分子标记[J]．南开大学学报(自然科学)，2001，34(1)：5～9
[108] 王晓梅，宋文芹，刘松，陈瑞阳．与银杏性别相关的RAPD标记[J]．南开大学学报(自然科学)，2001，34(3)：116～117
[109] 惠东威，陈受宜．RAPD技术及其原理[J]．生物工程进展，1992，12(6)：1～5
[110] Zietkiewicz E, Rafalski A, Labuda D. Genome fingerp rinting by simple slequence repeats (SSR) - anchored polymerase chain reac Ti on amp lification[J]. Genomics, 1994, 20: 176～183.
[111] 冯富娟，王凤友，刘彤．红松ISSR-PCR实验系统影响因[J]．植物学通报，2004，21(3)：326～331
[112] 林万明．PCR技术操作和应用指南[M]．北京：人民军医出版社，1993，7～14．
[113] 余艳，陈海山，葛学军．简单重复序列区间(ISSR)引物反应条件优化与[J]．热带亚热带作物报，2003，11(1)：15～19．
[114] 李忠超．特有濒危植物八角莲遗传多样性研究(硕士学位论文)[D]．杭州：浙江大学，2002．57～58．
[115] 马朝芝，傅廷栋，Stine Tuevesson等．用ISSR标记技术分析中国和瑞典甘蓝型油菜的 遗传多样性[J]．中国农业科学，2003，36(11)：403～-1408．
[116] 续九如，黄智慧．林业试验设计[M]．北京：中国林业出版社，1998．65～79
[117] Kasai K, Morikawa Y, Sorri. V A, et al. Development of SCAR markers to the PVY resistance gene Ryadg based on common feature of plant disease resistance genes[J]. Genome, 2000, 43: 1～8
[118] Horejsi T, Box M J, Staub E J. Efficiency of randomly amplification polymorphic DNA to sequence characterized amplified region marker conversion and their comparative polymerase chain reaction sensitivity in cucumber[J]. J. Amer. See. Hort. Sci., 1999, 124(2):128～135
[119] 王倩．桃树“京玉”细菌人工染色体文库的构建及其抗病同源基因的分离[D]．博士学位论文，北京：中国科学院遗传研究所，2001
[120] Lahogue F, This P,. Bonquet A. Identification of a codominant SCAR marker linked to the seedlessness character in grapevine, Theor, Appl[J]. Genet, 1998, 97:950～959
[2] 汪俏梅，曾广文，将有条．苦瓜性别表现研究概况及展望[J]．中国蔬菜，1995，4：50～53
[3] Laibach F.uber sommer and winterannuelle rasse von Arabidopsis thaliana (l.) Heynh. Ein Beitrag Zur Atiologie der Blutenbildung[J]. Beitr Bid Pflanz,1951,28:173～210
[4] 汪俏梅．苦瓜四季丰产栽培[M]．北京：科学技术出版社．2001，16(1)：45～46
[5] Prakash G. Effect if photoperiod a-NAA and MH on sex expression and sex-ratio in bitter-gourd (Momordica charantia L.) [J]. plant science, 1974,6:97～99
[6] 汪俏梅，曾广文，蒋有条．温度和光周期对苦瓜性别表现的影响[J]．中国蔬菜，1997(1)：1～4
[7] Page T, Macknight R, Yang C H, et al. Genetic interactions of the Arabidopsis flowering time gene FCA. with genes regulating floral initiation[J]. Plant,1999,17:231～239.
[8] 刘波，郑国生，闫志佩，王宗正．低温处理对牡丹春节催花及营养类物质变化的影响[J]．西北植物学报，2004，24(9)：1635-1639
[9] 张志炎，刘长庆，孙发仁．春化条件对大白菜花芽分化及种株发育的影响[J]．中国蔬菜，1995(5)：35-36
[10] 李兴军，李三玉，汪国云等．杨梅花芽孕育期间叶片酸性蔗糖酶活性及糖类含量的变化[J]．四川农业大学学报，2000，18(2)：164～166
[11] 汪俏梅，曾广文．苦瓜性别分化的形态与组织化学研究[J]．浙江农业大学学报，1997，23(2)：149～153
[12] Buban T, Faust M.Flower bud induction in apple tree:Internal Control Differentiation[J]. Hort.Rev,1982,4:174
[13] Faust M. Physiology of temperate zone fruit trees[M]. New York:John Wiley and Sons,1989
[14] 黄海．关于果树花芽分化的研究[J]．果树科学，1987，4(3)：41～47
[15] 张万萍，史继孔．银杏雄花芽分化期间内源激素、碳水化合物和矿质营养含量的变化[J]．林业科学，2004，40(2)：51～54
[16] Corbesier L, Lejiune P, Bernier G. The role of carbohydrates in the induction of flowering in Arabidopsis thaIiana: comparison between the wild type and a starchless mutant[J]. Planta,1998,206 (1): 131～137
[17] 邓俭英，张玲玲，张曼等．苦瓜花芽不同分化期的形态及糖含量研究[J]．广西农业科学，2007，37(4)：422～425
[18] 方得秋，肖顺元，章文才．柑桔同工酶组织器官特异性研究[J]．浙江柑橘，1991，4：4～6
[19] 应振土，李曙轩．瓠瓜与黄瓜的性别表现和内源乙烯与氧化酶活性的关系[J]．园艺学报，1990，(1)：51～57
[20] 艾辛，祝莉莉，舒理慧等．黄瓜植株性别表现与3种氧化酶同工酶的关系[J]．武汉植物学研究，2000，18(3)：184～188
[21] 张玲玲．苦瓜性别分化的形态学及生理基础研究(硕士学位论文)[D]．南宁：广西大学，2006：17～20
[22] 汪俏梅，曾广文．苦瓜性别分化的特异蛋白质研究[J]．植物学报，1998，40(3)：241～246
[23] 龙程，潘瑞炽．雌雄石刁柏嫩茎的蛋白质含量何超氧物歧化酶活性研究[J]．园艺学报，1992，19(4)：373～374
[24] 郭金丽，张玉兰．苹果梨花芽分化期蛋白质、淀粉代谢的研究[J]．内蒙古农牧学院学报，1999，20(2)：80～82
[25] 李曙轩．乙烯利及赤霉素对瓠瓜性别的影响[J]．植物生理学报，1981，7(3)：265
[26] Ursin VN, Yamaguchi J, Mecormick S. Gametophytic and sporophytic expression of anther-specific genes in development tomato anthers[J].Plant cell, 1989,1:727
[27] 汪俏梅，曾广文．激素和多胺对苦瓜性别分化的影响[J]．园艺学报，1997，24(1)：48～52
[28] Meyerowitz EM. The genetics of flower development[J], scientific America, 1994, 27(5):40
[29] Tassoni A, Van Buren M.Franceschetti M.Fornale S,BagniN.Polyamine content and metabolism in Arabidopsis thaliana and effect of spermideine on plant development[J].Plant Physiol Biochem, 2000,38(5):383～393
[30] Dellaporta S L, Calderon-Urrea A. Sex determination in flowering plants[J]. Plant Cell, 1993,5(10):1241～1251
[31] Trebitsh J,Staub J E, Onell S D. Identification of a 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid synthasegene linked to the female(F) locus that enhances female sex expression in cucumber[J]. Plant Physiol,1997,113:987～995
[32] Perl-Treves R,Kahana A,Rosenman N,et al.Expression of multiple AGAMOUS-like genes in male and female flowers of cucumber(Cucumis sativus L.) [J]. Plant CellPhysiol, 1998,39(7): 701～710
[33] 杨满业，赵茂俊，徐莺，唐琳，白洁，陈放．苦瓜MADS盒基因的克隆和表达研究[J]．北京林业大学学报，2004，26(4)：30～35
[34] 陈中海．番木瓜性别的生化标记和分子标记研究(硕士学位论文)[D]．福州：福建农林大学，2001：22
[35] 徐玉波．黄瓜性别分化相关的遗传标记研究(硕士学位论文)[D]．南京：南京农业大学，2004：57～66
[36] 韦第．罗汉果性别的分子标记研究(硕士学位论文)[D]．南宁：广西大学，2005：18～30
[37] 张潞生．猕猴桃雌雄性别AFLP和RAPD标记(博士学位论文)[D]．北京：中国农业大学，2000：40～56
[38] 周玉亮．分子标记技术及其在植物遗传育种中的应用[J]．生物技术通讯，2005，5：350～352
[39] 周延清．DNA分子标记技术在植物研究中的应用[M]．化学工业出版社，2005，5：3～4
[40] 邢少辰，蔡玉红，尹会兰．遗传标记的发展及应用[J]．邯郸农业高等专科学校学报，2000，17(2)：2
[41] Williams JGK, Kubelik AR, Livak KJ, et al. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers areuseful as genetic markers[J]. Nucleic Acids Res, 1990, 18 (22): 6531～6535.
[42] Welsh J, Mc Clelland M. Fingerp rinting genomesusing PCR with arbitrary primers[J]. Nucleic Acids Res, 1990, 18(24): 7213～7218.
[43] rnheim N, Erlich H. Polymerase chain reaction strategy[J]. Annu Rev Biochem, 1992, 61: 131～156
[44] 惠东威，陈受宜．RAPD技术及其原理[J]．生物工程进展，1992，12(6)：1～5
[45] 贾继增．分子标记种质资源鉴定和分子标记育种[J]．中国农业科学，1996，29 (4): 1～10
[46] PillayM, Kenny ST. Anomalies of direct pairwise comparison of RAPD fragment for genetic analysis [J]. BioTechniques, 1995,19: 694～698
[47] Paran I, Kesseli R,Michelmore R. Development of reliable PCR -based markers linked to downy mildew resistance genes in lettuce[J]. TheorApplgenet,1993,85:985～993
[48] T.Debener, T.Janakiram and L.Mattiesch. Sports and seedlings of rose varieties analysed with molecular markers[J]. Plant Breeding, 2000, 119:71-74.
[49] Moreno S, Martin J.P., and Ortiz J.M.. Inter-simple sequence repeats PCR for characterization of closely related grape vinegermplasm[J]. Euphytica.1998, 101:117～125.
[50] Zietkiewicz E, Rahh A, Labuda D. Genome fingerprinting by simple sequence repeat (SSR) -anchored polymerase chain reaction amplification[J].genomics.1994,20:176～183
[51] Gupta M,ChylY S,Romero—Seven, son J,Owen JL.Ampiification of DNA marker from evolutionarily diverse genomesusing simple primers of simple-flequence repeats[J].Theor Appl Genet.1994,89:998～1006
[52] 高慧敏，张颖君，宋炳彦，梁玉芹．分子标记在蔬菜种质资源和育种上的应用[J]．河北农业科学，2005，6(2)：78～81
[53] RoderM. S., KorzunV., WendehakeK, PlaschkeJ., TixierMH, LeroyP., and Ganal M.W. A microsatellite map of wheat[J].Genetics. 1998,149(4):2007～2023
[54] 邓俭英，刘忠，康德贤，方锋学．RAPD分子标记技术在蔬菜研究中的应用[J]．种子，2005，3：39～42
[55] Blair M.W, Panaud O., and M Couch S.R. Inter-simple sequence repeat (ISSR) amplification for analysis of microsatellite motif sequence and fingerprinting in rice (Oryza sativa L),Theor. Appl[J]. Genet., 1999,98:780～792
[56] 胡学军，邱正明．RAPD分子标记技术及其在十字花科蔬菜研究中的应用[J]．湖北农业科学，2005，3：107～110
[57] 孙妮，胡开林，张长远．RAPD技术鉴定苦瓜杂种一代的研究[J]．广东农业科学，2005，1：40～42
[58] 张菊平．RAPD技术在苦瓜、辣椒一代杂种种子纯度鉴定上的应用研究[D]．硕士学位论文，2003：26～29
[59] Wolfe AD,Xiang QY, Kephart SR1.Diploid hybrid speciation in Penstemon (Scrophulariaceae) [J]. Proc Natl Acad SciuSA ,1998, 95: 5112～5115.
[60] 秦莲花，宋春艳，谭琦，陈明杰，潘迎捷．用ITS和ISSR分子标记技术鉴别香菇生产用种[J]．菌类学报，2006，25(1)：94～100
[61] 王建波．ISSR分子标记及其在植物遗传学研究中的应用[J]．遗传，2002，24(5)：613～616
[62] 孙洪，程静，詹克慧，张相武，杨艳会．ISSR标记技术及其在作物遗传育种中的应用[J]．分子植物育种，2005，3(1)：123～127
[63] 张长远，孙妮，胡开林．苦瓜品种亲缘关系的RAPD分析[J]．分子植物育种，2005，3(4)：515～519
[64] 刘万勃，宋明，刘富中．RAPD和ISSR标记对甜瓜种遗传多样性的研究[J]．农业生物技术学报，2002，10(3)：231～236
[65] Eiadthong W, Yonemori K, Sugiura A., et al. Identification of mango cuhivars of Thailand and evaluation of their genetic variationusing the amplified fragments by simple sequence repeat (SSR) anchored primers[J]. Sci Hor,1999,82:57～66
[66] Lanham PG, Korycinska A, Brennan RM. Genetic diversity within a secondary gene pool for Ribes nigrum L.revealed by RAPD and ISSR markers[J]. Holt. Sci. Biotch,2000,75(4): 371～375.
[67] Moreno S, Martin JP, Ortiz JM.. Inter-simple sequence repeats PCR for characterization of closely related grapevine germplasm[J]. Euphytica,1998,117～125
[68] 杨若林，孔俊，吴鑫，邓志瑞，陈沁，刘文轩．ISSR标记在辣椒资源遗传多态性分析中的初步应用[J]．上海大学学报：自然科学版，2005，11(4)：423～426，435
[69] 张仁兵，易克，许勇．用重组自交系构建西瓜分子遗传图谱[J]．分子植物育种，2003，1(4)：481～489
[70] 易克，徐向利，卢向阳，许勇，肖浪涛，王永健，康国斌．利用SSR和ISSR标记技术构建西瓜分子遗传图谱[J]．湖南农业大学学报：自然科学版，2003，29(4)：333～337
[71] 陈劲枫，娄群峰，余纪柱，庄飞云．黄瓜性别基因连锁的分子标记筛选[J]．上海农业学报，2003，19(4)：11～14
[72] 许勇，欧阳新星，张海英等．与西瓜野生种质抗枯萎病基因连锁的RAPD标记[J]．植物学报，1999，41(9)：952～955．
[73] 盖树鹏，孟翔栋．大葱胞质雄性不育基因的RAPD标记[J]．农业生物技术学报，2002，10(1)：94～97．
[74] Martin GB., Williams JGK, Tanksley SD. Identification of markers linked to disease2resistance genes by bulked segregation analysis: Arapidmethod to detectmarkers in specific genomic regionsbyusing segregation population[J]. Proc NatlAcad SciUSA, 1991, 88:9828～9832
[75] 吴旭红．甜菜抗丛根病基因(Rz1)ISSR分子标记的初步研究[J]．中国糖料，2005，2：9～11
[76] 吴旭红．甜菜抗根腐病基因ISSR分子标记的初步研究[J]．齐齐哈尔大学学报，2005，6(2)：30～32
[77] 曹必好，宋洪元，雷建军等．结球甘蓝抗TuMV相关基因的克隆[J]．遗传学报，2002，29(7)：646～652
[78] 盖树鹏，孟祥栋．利用RAPD技术进行植物性状标记及辅助选择[J]．生物技术通报．1999．6：33～37
[79] Serquen FC,Bacher J,and Staub JE.Mapping and QTL, analysis of horticultural traits in a narrow cross in cucumber(Cucumis Stivis L.)using random amplified polymorphic DNA marker[J]. Mmolecular. Breeding,1997,3:257～268
[80] Yu YG, Saghai MA, Buss GR1 Divergenceand allelomorphic relationshipofa soybean virusresistance gene based of tightly linked DNA microsatellite and RFLP markers[J]. Theor Appl Genet ,1996,92:642～691
[81] Michelmore R W, Paran I, Kesseli R V. Identification of markers linked to disease-resistance genes by bulked segregant analysis: A rapid method to detect markers in specific genomic regions byusing segregatingpopulations[J]. Proc Natl Acad SciuSA, 1991,88:9823～9832.
[82] 王得元，邓义才，李乃坚．RAPD标记检测蔬菜种子纯度中DNA提取方法研究[J]．广东农业科学，1999(3)：13～14
[83] 傅荣昭，孙勇昭，贾士荣．植物遗传转化技术手册[M]．北京：中国科学技术出版社，1994．131～137
[84] 王关林，方宏筠．植物基因工程原理与技术[M]．北京：科学出版社，1998：598～602
[85] 奥斯伯，金斯顿，塞德曼等．精编分子生物学实验指南[M]．北京：科学出版社，2005
[86] 萨姆布鲁克(Sambrook，J)，金冬雁等．分子克隆实验指南[M]．北京：科学出版社，2002
[87] 向太和，王利琳，胡江琴，庞基良，余爱华．不同性别类型黄瓜品种基因组DNA的提取及RAPD标记的初步研究[J]．杭州师范学院学报(自然科学版)，2005，3(2)：121～124
[88] 娄群峰，陈劲枫，Molly Jahn，陈龙正，耿红，罗向东．黄瓜全雌性基因连锁的AFLP和SCAR分子标记[J]．园艺学报，2005，32(2)：256～261
[89] Mandolino G, CarboniA, Forapani S, FaetiV, Ranalli P. Identification of DNA markers linked to themale sex in dioecious hemp (Cannabis sativa L.) [J]. Theor Appl Genet.1999, 9(1): 86～92.
[90] 马尼阿蒂斯(Maniatis，T．)．分子克隆实验手册[M]．杭州：浙江科学技术出版社，1987
[91] 何正文，刘运生，陈立华等．正交设计直观分析法优化PCR条件[J]．湖南医科大学学报，1998，23(4)：403～404
[92] 谢运海，夏德安，姜静等．．利用正交设计优化水曲柳ISSR—PCR反应体系[J]．分子植物育种，2005，3(3)：445～450
[93] 刘海河，侯喜林，张彦萍．西瓜ISSR-PCR体系的正交优化研究[J]．果树学报，2004，21(6)：615～617
[94] 林萍，张含国，谢运海．正交设计优化落叶松ISSR-PCR反应体系[J]．生物技术，2005，15(5)：34～37
[95] 邹喻苹，葛颂，王晓东．系统与进化植物学中的分子标记[M]．北京：科学出版社，2001
[96] 宣继平，章镇．适合于苹果ISSR反应体系的建立[J]．植物生理学通讯，2002，38(6)：549～550
[97] 乔玉山，章镇，房经贵等．李种质资源ISSR反应体系的建立[J]．果树学报，2002，20(4)：270～274
[98] 余艳，陈海山，葛学军．简单重复序列区间(ISSR)引物反应条件优化与筛选[J]．热带亚热带植物学报，2003，11(1)：15～19
[99] 张今今，王跃进．苹果PAPD反应体系的研究[J]．西北农业大学学报，2000，28(5)：6559
[100] 王得元，张长远等．辣椒RAPD反应体系研究[J]．广东农业科学，2001，(1)：21～22
[101] 曾莉娟，郑成木．硅胶干燥旱稻叶片制备DNA样品及其RAPD反应体系的建立[J]．热带农业科学，2002，22(5)：9～12
[102] 蒋曹德，邓昌彦．随机扩增多态DNA规范化反应技系探讨[J]．生物技术通报，2002，158(3)：40～43
[103] Michelmore R W.Identification of marker linked to disease resistance gene by bulked segregant analysis:A rapid method detect marker in specific genomic regions byusing segregating populations[J]. Proc Nat Acad SciuSA,1991,88:9828～9832.
[104] 陈其军，韩玉珍，傅永福等．大麻性别的RAPD和SCAR分子标记[J]．植物生理学报，2001，27(2)：173～178
[105] 李兴国，李全梓，张宪省．黄瓜性别决定的细胞学研究[J]．山东农业大学学报(自然科学版)，2001，32(4)：411～417
[106] Reamon Buttner SM, SchondelmaierJ, Jung C. AFLPmarkers tightly linked to the sex locus in Asparagus officinalisL[J]. MolecularBreeding, 1998, 4 (2):91～98.
[107] 宋文芹，刘松，李秀兰，陈瑞阳．利用AFLP技术筛选与银杏性别相关的分子标记[J]．南开大学学报(自然科学)，2001，34(1)：5～9
[108] 王晓梅，宋文芹，刘松，陈瑞阳．与银杏性别相关的RAPD标记[J]．南开大学学报(自然科学)，2001，34(3)：116～117
[109] 惠东威，陈受宜．RAPD技术及其原理[J]．生物工程进展，1992，12(6)：1～5
[110] Zietkiewicz E, Rafalski A, Labuda D. Genome fingerp rinting by simple slequence repeats (SSR) - anchored polymerase chain reac Ti on amp lification[J]. Genomics, 1994, 20: 176～183.
[111] 冯富娟，王凤友，刘彤．红松ISSR-PCR实验系统影响因[J]．植物学通报，2004，21(3)：326～331
[112] 林万明．PCR技术操作和应用指南[M]．北京：人民军医出版社，1993，7～14．
[113] 余艳，陈海山，葛学军．简单重复序列区间(ISSR)引物反应条件优化与[J]．热带亚热带作物报，2003，11(1)：15～19．
[114] 李忠超．特有濒危植物八角莲遗传多样性研究(硕士学位论文)[D]．杭州：浙江大学，2002．57～58．
[115] 马朝芝，傅廷栋，Stine Tuevesson等．用ISSR标记技术分析中国和瑞典甘蓝型油菜的 遗传多样性[J]．中国农业科学，2003，36(11)：403～-1408．
[116] 续九如，黄智慧．林业试验设计[M]．北京：中国林业出版社，1998．65～79
[117] Kasai K, Morikawa Y, Sorri. V A, et al. Development of SCAR markers to the PVY resistance gene Ryadg based on common feature of plant disease resistance genes[J]. Genome, 2000, 43: 1～8
[118] Horejsi T, Box M J, Staub E J. Efficiency of randomly amplification polymorphic DNA to sequence characterized amplified region marker conversion and their comparative polymerase chain reaction sensitivity in cucumber[J]. J. Amer. See. Hort. Sci., 1999, 124(2):128～135
[119] 王倩．桃树“京玉”细菌人工染色体文库的构建及其抗病同源基因的分离[D]．博士学位论文，北京：中国科学院遗传研究所，2001
[120] Lahogue F, This P,. Bonquet A. Identification of a codominant SCAR marker linked to the seedlessness character in grapevine, Theor, Appl[J]. Genet, 1998, 97:950～959