温度和盐度对西藏拟溞抗氧化酶及热休克蛋白HSP70基因表达的影响
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摘要
环境因子（温度、盐度、PH等）的改变不仅能够影响水生生物的呼吸和代谢，同时还可造成机体自由基代谢紊乱，若生物体长期处于应激状态会导致机体免疫防御能力下降，从而影响生物正常生长。研究水生生物抗氧化效应以及热休克蛋白对于探索其环境适应机制和提高机体抗氧化免疫能力具有重要意义。本试验是在光照强度1500lx，光周期为12L：12D、pH8.1的条件下，研究了温度和盐度对西藏拟溞（Daphniopsis tibetana Sars）的抗氧化酶及脂质过氧化作用的影响；同时，利用分子生物学手段研究了温度和盐度对西藏拟溞体内热休克蛋白70（HSP70）基因表达的规律，以此来探讨西藏拟溞对环境的耐受性机制。主要研究内容和结果如下：
1.温度和盐度对西藏拟溞抗氧化酶及脂质过氧化作用的影响
采用实验生态学的方法，研究了温度（T=16℃、19℃、22℃、25℃、28℃）、盐度（S=5、10、15、20、25）对西藏拟溞总超氧化物歧化酶（T-SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）活力以及脂质过氧化产物丙二醛（MDA）含量的影响。结果表明：温度和盐度因子能够诱导西藏拟溞抗氧化应激反应，胁迫24h后，SOD、GPX活性及MDA含量在28℃，盐度20时均达到最高值，分别为37.18±1.97U/mg﹒μg、75.1±9.96U/mg﹒μg、12.24±2.12nmol/mg·μg；48h后，高温低盐组（25~28℃、5~10）和高温高盐组（25~28℃、20~25）SOD、GPX活性及MDA含量显著高于其他处理组（P<0.05），在28℃，盐度5时均达到最大值，分别为19.25±3.48U/mg﹒μg、59.95±4.66U/mg﹒μg、4.98±0.66nmol/mg·μg；温度、盐度以及这两个因子之间对西藏拟溞体内SOD、GPX活性和MDA含量均有极显著影响（P<0.01）。
2.温度和盐度对西藏拟溞热休克蛋白70基因表达的影响
生物对温度和盐度变化后的生理反应能够反映出生物体对其环境的适应性及耐受能力。为了研究西藏拟溞对温度和盐度胁迫的生理反应，本试验利用SYBR Green荧光定量RT-PCR技术对温度和盐度处理后西藏拟溞hsp70mRNA表达量进行了定量分析，探讨西藏拟溞在应激反应中hsp70mRNA的表达规律。结果表明：温度和盐度的改变能够影响西藏拟溞体内hsp70的表达量。胁迫24h后，随着温度的升高，西藏拟溞体内hsp70的表达量呈先升高后降低再升高趋势，22℃和28℃显著高于其他处理组（P<0.05），在22℃，盐度为10时表达达到最高值7.60.72，是对照组（16℃，盐度15）的7倍。随着盐度的改变hsp70的表达量变化均有显著性变化（P<0.05）；胁迫48h后，西藏拟溞体内hsp70的表达量随着温度的升高而增加，各温度组hsp70的表达量均显著高于16℃时hsp70的表达（P<0.05），温度28℃，盐度20时达到高峰6.360.22，是对照组hsp70的表达量的6倍。随着胁迫时间的延长，高温组（25~28℃）以及高盐组（20~25）hsp70的表达量均显著增加。西藏拟溞热休克蛋白70的表达对不同变盐方向的响应都较为敏感。
Environmental factors (temperature, salinity, pH, etc.) not only can affect thebreathing and metabolism of aquatic organisms, but also free radicals can causemetabolic disorders. The immune defense capabilities will be decreased If theorganism is in the effect of stress for a long time, thus affecting its normal growth.Itis of great significance to study the antioxidant effect and heat shock protein ofaquatic organisms to explore the mechanism of its adaptation to the environmentand improve the antioxidant immunity of aquatic organisms. The experiment wasdesigned to evaluate the effects of temperature and salinity on the activities ofantioxidant enzymes and lipid peroxidation of Danphniopsis tibetana Sars under theconditions of1500lx, photoperiod(12L:12D) and PH8.1in the laboratory, and underthe same conditions, research the effect of temperature and salinity on HSP70geneexpression of Daphniopsis tibetana Sars by molecular biology methods to explorethe tolerance mechanisms on the environment. The major results and conclusionsare as follows:
1. Effects of Temperature and Salinity on the Activities of Antioxidant enzymesand Lipid peroxidation of Danphniopsis tibetana Sars
The experiment was designed to evaluate the effects of temperature（16℃、19℃、22℃、25℃、28℃）and salinity（5、10、15、20、25）on the activity oftotal superoxide dismutase(T-SOD)、 glutathione peroxidase(GPX) and maleicdialdehyde(MDA) of Danphniopsis tibetana Sars by ecological method under thelaboratory conditions.The results showed that temperature and salinity inducedadaptive responses such as increase the activities of SOD、GPX and the content ofMDA with temperature and salinity raised to28℃,25, the maximum were37.18±1.97U/mg﹒μg、75.1±9.96U/mg﹒μg、12.24±2.12nmol/mg﹒μg;48hours later, the experimental groups of high temperature and lower salinity(25~28℃、5~10) and the experimental groups of high temperature and highersalinity (25~28℃、20~25) had interactive effects. when28℃,S=5, those raised tothe maximum19.25±3.48U/mg﹒μg、59.95±4.66U/mg﹒μg、4.98±0.66nmol/mg μg. There were interactive effects between the two factors on theantioxidant enzymatic activities(SOD、GPX) and lipid peroxidation(MDA) inDanphniopsis tibetana Sars（P<0.01）.
2. Effect of temperature and salinity on hsp70mRNA expression of Daphniopsis tibetana Sars
Physiological responses to temperature and salinity reflect the evolutionaryadaptations of organisms to their environment and the capability of animals totolerate stress. To study the physiological adaptations of Daphniopsis tibetana Sarsto temperature and salinity stress, hsp70mRNA expression levels of Daphniopsistibetana Sars were analyzed by SYBR Green fluorescence quantitative RT-PCR.The results showed that temperature and salinity induced adaptive responses such asincrease hsp70mRNA expression first and then decrease and then increased as thetemperature increased. When the temperature and salinity raised to22℃,10, themaximum was7.60.72, the hsp70mRNA expression was7times higher than thecontrol group(16℃，15).There were significant difference between the groups of22℃、28℃and the other groups. The expressions of hsp70were significantlydifferece with the amount of salinity changes （P<0.05）;48hours later, thetendency of hsp70expression level was increased with the temperature raised. Thehsp70expression level of D. tibetana was much higher than the control group（P<0.05）, the maximum was6.360.22, the hsp70mRNAexpression was6timeshigher than the control group(16℃，15). The hsp70expressions of high temperature(25to28℃) and high-salt groups (20to25) were significantly increased with thetime prolonged. The hsp70expression level of D. tibetana was more sensitive to thesalinity-up treatment and the salinity-drop treatment.
1.温度和盐度对西藏拟溞抗氧化酶及脂质过氧化作用的影响
采用实验生态学的方法，研究了温度（T=16℃、19℃、22℃、25℃、28℃）、盐度（S=5、10、15、20、25）对西藏拟溞总超氧化物歧化酶（T-SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）活力以及脂质过氧化产物丙二醛（MDA）含量的影响。结果表明：温度和盐度因子能够诱导西藏拟溞抗氧化应激反应，胁迫24h后，SOD、GPX活性及MDA含量在28℃，盐度20时均达到最高值，分别为37.18±1.97U/mg﹒μg、75.1±9.96U/mg﹒μg、12.24±2.12nmol/mg·μg；48h后，高温低盐组（25~28℃、5~10）和高温高盐组（25~28℃、20~25）SOD、GPX活性及MDA含量显著高于其他处理组（P<0.05），在28℃，盐度5时均达到最大值，分别为19.25±3.48U/mg﹒μg、59.95±4.66U/mg﹒μg、4.98±0.66nmol/mg·μg；温度、盐度以及这两个因子之间对西藏拟溞体内SOD、GPX活性和MDA含量均有极显著影响（P<0.01）。
2.温度和盐度对西藏拟溞热休克蛋白70基因表达的影响
生物对温度和盐度变化后的生理反应能够反映出生物体对其环境的适应性及耐受能力。为了研究西藏拟溞对温度和盐度胁迫的生理反应，本试验利用SYBR Green荧光定量RT-PCR技术对温度和盐度处理后西藏拟溞hsp70mRNA表达量进行了定量分析，探讨西藏拟溞在应激反应中hsp70mRNA的表达规律。结果表明：温度和盐度的改变能够影响西藏拟溞体内hsp70的表达量。胁迫24h后，随着温度的升高，西藏拟溞体内hsp70的表达量呈先升高后降低再升高趋势，22℃和28℃显著高于其他处理组（P<0.05），在22℃，盐度为10时表达达到最高值7.60.72，是对照组（16℃，盐度15）的7倍。随着盐度的改变hsp70的表达量变化均有显著性变化（P<0.05）；胁迫48h后，西藏拟溞体内hsp70的表达量随着温度的升高而增加，各温度组hsp70的表达量均显著高于16℃时hsp70的表达（P<0.05），温度28℃，盐度20时达到高峰6.360.22，是对照组hsp70的表达量的6倍。随着胁迫时间的延长，高温组（25~28℃）以及高盐组（20~25）hsp70的表达量均显著增加。西藏拟溞热休克蛋白70的表达对不同变盐方向的响应都较为敏感。
Environmental factors (temperature, salinity, pH, etc.) not only can affect thebreathing and metabolism of aquatic organisms, but also free radicals can causemetabolic disorders. The immune defense capabilities will be decreased If theorganism is in the effect of stress for a long time, thus affecting its normal growth.Itis of great significance to study the antioxidant effect and heat shock protein ofaquatic organisms to explore the mechanism of its adaptation to the environmentand improve the antioxidant immunity of aquatic organisms. The experiment wasdesigned to evaluate the effects of temperature and salinity on the activities ofantioxidant enzymes and lipid peroxidation of Danphniopsis tibetana Sars under theconditions of1500lx, photoperiod(12L:12D) and PH8.1in the laboratory, and underthe same conditions, research the effect of temperature and salinity on HSP70geneexpression of Daphniopsis tibetana Sars by molecular biology methods to explorethe tolerance mechanisms on the environment. The major results and conclusionsare as follows:
1. Effects of Temperature and Salinity on the Activities of Antioxidant enzymesand Lipid peroxidation of Danphniopsis tibetana Sars
The experiment was designed to evaluate the effects of temperature（16℃、19℃、22℃、25℃、28℃）and salinity（5、10、15、20、25）on the activity oftotal superoxide dismutase(T-SOD)、 glutathione peroxidase(GPX) and maleicdialdehyde(MDA) of Danphniopsis tibetana Sars by ecological method under thelaboratory conditions.The results showed that temperature and salinity inducedadaptive responses such as increase the activities of SOD、GPX and the content ofMDA with temperature and salinity raised to28℃,25, the maximum were37.18±1.97U/mg﹒μg、75.1±9.96U/mg﹒μg、12.24±2.12nmol/mg﹒μg;48hours later, the experimental groups of high temperature and lower salinity(25~28℃、5~10) and the experimental groups of high temperature and highersalinity (25~28℃、20~25) had interactive effects. when28℃,S=5, those raised tothe maximum19.25±3.48U/mg﹒μg、59.95±4.66U/mg﹒μg、4.98±0.66nmol/mg μg. There were interactive effects between the two factors on theantioxidant enzymatic activities(SOD、GPX) and lipid peroxidation(MDA) inDanphniopsis tibetana Sars（P<0.01）.
2. Effect of temperature and salinity on hsp70mRNA expression of Daphniopsis tibetana Sars
Physiological responses to temperature and salinity reflect the evolutionaryadaptations of organisms to their environment and the capability of animals totolerate stress. To study the physiological adaptations of Daphniopsis tibetana Sarsto temperature and salinity stress, hsp70mRNA expression levels of Daphniopsistibetana Sars were analyzed by SYBR Green fluorescence quantitative RT-PCR.The results showed that temperature and salinity induced adaptive responses such asincrease hsp70mRNA expression first and then decrease and then increased as thetemperature increased. When the temperature and salinity raised to22℃,10, themaximum was7.60.72, the hsp70mRNA expression was7times higher than thecontrol group(16℃，15).There were significant difference between the groups of22℃、28℃and the other groups. The expressions of hsp70were significantlydifferece with the amount of salinity changes （P<0.05）;48hours later, thetendency of hsp70expression level was increased with the temperature raised. Thehsp70expression level of D. tibetana was much higher than the control group（P<0.05）, the maximum was6.360.22, the hsp70mRNAexpression was6timeshigher than the control group(16℃，15). The hsp70expressions of high temperature(25to28℃) and high-salt groups (20to25) were significantly increased with thetime prolonged. The hsp70expression level of D. tibetana was more sensitive to thesalinity-up treatment and the salinity-drop treatment.
引文
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