甘蓝型油菜—萝卜d染色体附加系中d染色体导入甘蓝的初步研究
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摘要
甘蓝型油菜-萝卜d染色体附加系(Rape-radish with d-chromosome addition line，AACC~(+dd)，2n=40)是通过甘蓝型油菜(Brassica nupus，AACC，2n=38)与萝卜(Raphanus sativus，RR，2n=18)的杂交，经杂种染色体加倍与母本多次回交获得的具萝卜d染色体的新型油菜材料。Peterka研究发现萝卜9条染色体中——d染色体具有抗线虫效应，而芸薹属(Brassica．CC，2n=18)植物则容易受线虫病侵染。本试验目的希望通过甘蓝型油菜-萝卜d染色体附加系与甘蓝的有性杂交，能够获得具有萝卜d染色体的杂种后代，为选育具线虫抗性的新型甘蓝品种提供相关品种材料。
甘蓝型油菜-萝卜d染色体附加系与甘蓝的杂交存在远缘杂交障碍，本试验选取染色体数目较多的附加系为母本、甘蓝为父本进行有性杂交，并通过人工干涉来促进亲和性提高。电镜观察父本花粉在附加系柱头上的萌发情况，异源花粉刺激柱头乳突细胞产生大量胼胝质以抵制花粉管的侵入，部分花粉管受阻，但仍有部分进入柱头并与胚珠结合。
花粉管能与雌配子结合是有性杂交成功的先决条件。在田间去雄授粉试验中，以甘氨酸(Gly 100mg/L)、赤霉素(GA_3 60mg/L)、重复授粉及无特殊处理对照(CK)对柱头进行处理，发现：三种特殊处理方式对促进杂交亲和性都有一定作用。其中GA_3 60mg/L能有效提高结籽率，重复授粉对促进结角效果最好。胚胎挽救可为胚的形成提供必要的养分和激素。本试验以不同发育天数的受精子房为培养对象，在不同培养基上进行子房培养，共获得26粒种子，并对不同子房天数和培养基效果进行比较：(1)普遍以10天左右的受精子房进行子房培养可获得高结籽率。(2)子房在“White(1963)+VB_6(0．5mg／L)+VB_1(0．5mg/L)+甘氨酸(15mg/L)+烟酸(2．5mg/L)+IAA(1．5 mg/L)+蔗糖(50g／L)，pH=5．6”和“1／2MS+B5维生素+IAA(1．5mg/L)+蔗糖(50g/L)，pH=5．8”这两种培养基上均能获得较高的结籽率，分别为3．37和4．26。
田间与离体培养获得的再生植株在形态学上偏向母本，个别形态标记如叶片形状等处于父母本中间型，极少数植株出现不同于父母本的浅紫色茎杆。利用已知萝卜d染色体的特异分子标记引物OPE07-363与OPE03-518对子代与父母本DNA进行RAPD实验，筛选出在363bp与518bp处有与母本d染色体特异带型相同的子代植株4株，并通过SSR标记与根尖细胞染色体计数来鉴定杂种真实性。经鉴定，子代植株DNA模板经与引物结合、PCR扩增电泳后于167bp与248bp处显示出不同于父母本的差异带型；对4株再生苗中存活的3株进行细胞学鉴定，显微镜下观察到根尖染色体数目分别是：29、29、48(或49)。即3株再生苗：2株三倍体(ACC~(+d)，3x=29)，和1株五倍体(AACCC~(+dd)，5x=49)或(AACCC~(+d)，5x=48)。从而确定这三株植株确为附加系do×甘蓝的真杂种。
花粉活力高低是决定植株育性的重要因素之一。醋酸洋红可与脱氢辅酶结合显红色，不具活力的花粉由于缺失脱氢辅酶从而不能染色。本试验将染色后的子代花粉与父母本相比较，子代花粉具有一定育性，但育性低，仅为11．32％；但有活力的子代花粉体大饱满，染色情况较父母本深，形态处于母父本花粉形态中间型。
Rape-radish with d-chromosome addition line(AACC~(+dd),2n=40)is the production:hybrid,obtained from Brassica nupus(AACC,2n=38)×Raphanus,sativus(RR,2n=18),via chromosome doubling and back crossing between Brassica nupus several times.Peterka's study and confirmed that the d chromosome in Raphanus sativus wasnematode resistance gene.In Brassica,plants lack of the kind of gene.
The goal of this study is to provide some germplasm materials for breeding a newBrassica nematode resistance variety according to get a hybrid with additionalD-chromosome by sexual cross between Rape-radish with d-chromosome addition lineand cabbage.
We selected the addition lines,which had more chromosomes,as the maternalplants,while the cabbage as the father plants,and observed the germination of thefather plants' pollen on the stigma of the addition line under the electron microscope.
The papilla cells of addition line secreted a lot of callose after the adhesion ofpollen,even though,part of the pollen can reach the stigma and combine with theovule.In the emasculation pollination of the field hybridization,we found that all theprocess methods of the stigma promoted the hybrid compatibility,no matter deal withGly(100mg/L),GA_3(60mg/L)or repeated pollination.Among these processions,GA3(60mg/L)can increase the seeding rate effectively,but repeated pollination grouphas the highest silique-setting rate.Ovary culture can increase the survival of theembryos.Then we cultured the fertilized ovaries,which were picked from the fieldwithout any special treatment,in different media,and finally harvested 26 seeds.Compared the results among different culture media,we found that the ovaries whichwere cultured in "White(1963)+VB_6(0.5mg/L)+VB_1 (0.5mg/L)+Gly (15mg/L)+Niacin (2.5 mg/L)+IAA(1.5 mg/L)+Sucrose (50g/L),pH=5.6" and "1/2MS+B5 vitamine solution+IAA(1.5 mg/L)+Sucrose (50g/L),pH=5.8" had more seeds.We also found that all the plants resembled their maternal plants morphologically,someplants' morphological marker,eg.the shape of leaves,was between the two.We usedthe known specific molecular markers of radish D-chromosome:OPE07-363 andOPE03-518 to conduct a RAPD test with the parent plants' DNA,and screened 4regenerated plants with d-chromosome marker to make the hybrid identification.Theaccuracy of morphology identification is lower than other methods,so we conduct achromosome count for the 3 surviving regenerated plants.The results showed that thefilial generations including 2 kinds of chromosome number:29 and 48(or 49).Thenwe determined the filial generation as the very hybrid of the addition line and cabbage by PCR amplification of their DNA,which would get 2 kinds of banding patterns thatown the characteristic strips of the parent generation but different from the both at thesame time.The test showed that the pollen viability of filial generation is about 11.32%,the particle of the fertile flower's pollen is full and large,and the shape is between thematernal plant and paternal plant.
甘蓝型油菜-萝卜d染色体附加系与甘蓝的杂交存在远缘杂交障碍，本试验选取染色体数目较多的附加系为母本、甘蓝为父本进行有性杂交，并通过人工干涉来促进亲和性提高。电镜观察父本花粉在附加系柱头上的萌发情况，异源花粉刺激柱头乳突细胞产生大量胼胝质以抵制花粉管的侵入，部分花粉管受阻，但仍有部分进入柱头并与胚珠结合。
花粉管能与雌配子结合是有性杂交成功的先决条件。在田间去雄授粉试验中，以甘氨酸(Gly 100mg/L)、赤霉素(GA_3 60mg/L)、重复授粉及无特殊处理对照(CK)对柱头进行处理，发现：三种特殊处理方式对促进杂交亲和性都有一定作用。其中GA_3 60mg/L能有效提高结籽率，重复授粉对促进结角效果最好。胚胎挽救可为胚的形成提供必要的养分和激素。本试验以不同发育天数的受精子房为培养对象，在不同培养基上进行子房培养，共获得26粒种子，并对不同子房天数和培养基效果进行比较：(1)普遍以10天左右的受精子房进行子房培养可获得高结籽率。(2)子房在“White(1963)+VB_6(0．5mg／L)+VB_1(0．5mg/L)+甘氨酸(15mg/L)+烟酸(2．5mg/L)+IAA(1．5 mg/L)+蔗糖(50g／L)，pH=5．6”和“1／2MS+B5维生素+IAA(1．5mg/L)+蔗糖(50g/L)，pH=5．8”这两种培养基上均能获得较高的结籽率，分别为3．37和4．26。
田间与离体培养获得的再生植株在形态学上偏向母本，个别形态标记如叶片形状等处于父母本中间型，极少数植株出现不同于父母本的浅紫色茎杆。利用已知萝卜d染色体的特异分子标记引物OPE07-363与OPE03-518对子代与父母本DNA进行RAPD实验，筛选出在363bp与518bp处有与母本d染色体特异带型相同的子代植株4株，并通过SSR标记与根尖细胞染色体计数来鉴定杂种真实性。经鉴定，子代植株DNA模板经与引物结合、PCR扩增电泳后于167bp与248bp处显示出不同于父母本的差异带型；对4株再生苗中存活的3株进行细胞学鉴定，显微镜下观察到根尖染色体数目分别是：29、29、48(或49)。即3株再生苗：2株三倍体(ACC~(+d)，3x=29)，和1株五倍体(AACCC~(+dd)，5x=49)或(AACCC~(+d)，5x=48)。从而确定这三株植株确为附加系do×甘蓝的真杂种。
花粉活力高低是决定植株育性的重要因素之一。醋酸洋红可与脱氢辅酶结合显红色，不具活力的花粉由于缺失脱氢辅酶从而不能染色。本试验将染色后的子代花粉与父母本相比较，子代花粉具有一定育性，但育性低，仅为11．32％；但有活力的子代花粉体大饱满，染色情况较父母本深，形态处于母父本花粉形态中间型。
Rape-radish with d-chromosome addition line(AACC~(+dd),2n=40)is the production:hybrid,obtained from Brassica nupus(AACC,2n=38)×Raphanus,sativus(RR,2n=18),via chromosome doubling and back crossing between Brassica nupus several times.Peterka's study and confirmed that the d chromosome in Raphanus sativus wasnematode resistance gene.In Brassica,plants lack of the kind of gene.
The goal of this study is to provide some germplasm materials for breeding a newBrassica nematode resistance variety according to get a hybrid with additionalD-chromosome by sexual cross between Rape-radish with d-chromosome addition lineand cabbage.
We selected the addition lines,which had more chromosomes,as the maternalplants,while the cabbage as the father plants,and observed the germination of thefather plants' pollen on the stigma of the addition line under the electron microscope.
The papilla cells of addition line secreted a lot of callose after the adhesion ofpollen,even though,part of the pollen can reach the stigma and combine with theovule.In the emasculation pollination of the field hybridization,we found that all theprocess methods of the stigma promoted the hybrid compatibility,no matter deal withGly(100mg/L),GA_3(60mg/L)or repeated pollination.Among these processions,GA3(60mg/L)can increase the seeding rate effectively,but repeated pollination grouphas the highest silique-setting rate.Ovary culture can increase the survival of theembryos.Then we cultured the fertilized ovaries,which were picked from the fieldwithout any special treatment,in different media,and finally harvested 26 seeds.Compared the results among different culture media,we found that the ovaries whichwere cultured in "White(1963)+VB_6(0.5mg/L)+VB_1 (0.5mg/L)+Gly (15mg/L)+Niacin (2.5 mg/L)+IAA(1.5 mg/L)+Sucrose (50g/L),pH=5.6" and "1/2MS+B5 vitamine solution+IAA(1.5 mg/L)+Sucrose (50g/L),pH=5.8" had more seeds.We also found that all the plants resembled their maternal plants morphologically,someplants' morphological marker,eg.the shape of leaves,was between the two.We usedthe known specific molecular markers of radish D-chromosome:OPE07-363 andOPE03-518 to conduct a RAPD test with the parent plants' DNA,and screened 4regenerated plants with d-chromosome marker to make the hybrid identification.Theaccuracy of morphology identification is lower than other methods,so we conduct achromosome count for the 3 surviving regenerated plants.The results showed that thefilial generations including 2 kinds of chromosome number:29 and 48(or 49).Thenwe determined the filial generation as the very hybrid of the addition line and cabbage by PCR amplification of their DNA,which would get 2 kinds of banding patterns thatown the characteristic strips of the parent generation but different from the both at thesame time.The test showed that the pollen viability of filial generation is about 11.32%,the particle of the fertile flower's pollen is full and large,and the shape is between thematernal plant and paternal plant.
引文
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