基于双荧光素酶报告体系的Cas9基因切割活性定量检测研究

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• 英文论文题名：Quantitative detection of CRISPR/Cas9 gene cleavage activity using dual luciferase report system
• 论文作者：王丹 ; 马德君 ; 董丽丽 ; 席真
• 英文论文作者：DanWang ; De-jun Ma ; Li-li Dong ; ZhenXi ; College of chemistry ; State Key Laboratory and Institute of Elemento-organic Chemistry ; Nankai University
• 年：2016
• 作者机构：南开大学化学学院元素有机化学国家重点实验室;
• 论文关键词：CRISPR/Cas9 ; 萤火虫双荧光酶报告体系
• 英文论文关键词：CRISPR/Cas9 ; Dual luciferase report system
• 会议召开时间：2016-07-01
• 会议录名称：中国化学会第30届学术年会摘要集-第二十八分会：化学生物学
• 语种：中文
• 分类号：Q78
• 学会代码：ZGHY
• 会议名称：中国化学会第30届学术年会-第二十八分会 ; 化学生物学
• 会议地点：中国辽宁大连
• 主办单位：中国化学会
• 学会名称：中国化学会
• 页数：1
• 文件大小：220k
• 原文格式：D
• 会议级别：全国

摘要

CRISPR/Cas9系统是近年来迅猛发展的新型基因编辑修饰技术。该技术以sg RNA作为引导链,对CRISPR/Cas9系统的靶向特异性、切割活性与生物安全性的优化具有重要指导意义~([1])。因此,很有必要发展一类更简便、更快速、更灵敏筛选出高效特异sg RNA序列的检测方法,这将极大缩短前期sg RNA活性评估周期。我们构建以萤火虫荧光素酶为靶标,海肾荧光素酶为内参的双荧光酶报告体系,通过萤火虫荧光与海肾荧光的比值能直观、快捷的对CRISPR/cas9系统的基因切割效率进行定量评估~([2])。结果表明,cas9质粒转染质量为400 ng,孵育48h后,PX458-firefly-sg12表现60%的切割活性,PX458-firefly-sg30、PX458-sod-sg34分别表现出42.3%、44.2%的切割活性。同时,双sg RNA表达质粒的引入,能更加显著提高基因的切割效率。因此,将这一体系发展为基因切割定量检测系统,具有较高的可行性,能方便于后续的高通量、多平行性的内源性基因sg RNA文库筛选与活性评估。
CRISPR/Cas9 is a newly-developed technology for gene editing,which relies on a single guide strand called sgRNA for target specificity,cleavage efficiency and genomic safety.Therefore,developing a fast and efficient method of determining sgRNA activity will reduce the evaluation period of highly-potent sgRNA screening.In this study,the relative ratio of firefly fluorescence and renilla fluorescence could directly reflect gene cleavage efficiency of gene-specific sgRNAs.After transfection with 400 ng Cas9 plasmid for 48 h,PX458-firefly-sgl2 exhibited high cleavage activity with the fluorescence loss of 60%,while PX458-firefly-sg30 and PX458-sod-sg34 showed modest cleavage activity with the fluorescence loss of 42.3% and 44.2%,respectively.Furthermore,after transfection with dual-sgRNA plasmids,the gene cleavage activity was greatly improved.Hence,quantitative detection of gene cleavage activity using dual luciferase report system was a fast,convenient and high-throughput method to facilitate the construction of endogenous sgRNA library and paralleled evaluation.

引文

[1]Pouecel C,Salvignol G,Vergnaud G.Microbiology,2005,151(3):653-663.
    [2]Wei L,Cao L,Xi Z.Angewandte Chemie,2013,125(25):6629-6631