PO22 - Étude de la régulation post-traductionnelle de la glucose-6-phosphatase par mutagénèse dirigée et spectrométrie de masse après immunoprécipitation

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• 作者：J. Chilloux¹ ; M. Soty¹ ; F. Delalande² ; F. Bertile² ; A. Van Dorsselaer² ; G. Mithieux¹ ; A. Gautier-Stein¹
• 刊名：Diabetes Metabolism
• 出版年：2011
• 出版时间：March 2011
• 年：2011
• 卷：37
• 期：1, Supplement 1
• 页码：A29
• 全文大小：50 K

文摘

Introduction

La glucose-6-phosphatase (G6Pase) est l’enzyme clé de la production endogène de glucose, au carrefour de la glycogénolyse et de la néoglucogenèse. Des données du laboratoire montrent une augmentation de l’activité G6Pase par l’AMPc, dépendante de la PKA. Nous avons étudié la phosphorylation de la sous unité catalytique de la G6Pase (G6PC) par mutagénèse dirigée et par spectrométrie de masse (MS). La G6PC étant faiblement exprimée, nous avons développé au préalable une méthode d’immunoprécipitation.

Matériels et méthodes

L’activité G6Pase est mesurée après mutation des sites de phosphorylation théoriques de la PKA sur la G6PC en alanine (empêche la phosphorylation) ou en aspartate (mime une phosphorylation constitutive). Afin d’en déterminer les éventuels sites de phosphorylation, l’analyse structurale de la G6PC endogène d’hépatocytes est réalisée par MS (nanoLC-MS/MS) après immunoprécipitation et séparation sur gel monodimensionnel.

Résultats

L’analyse de séquence de la G6PC révèle deux sites potentiels de phosphorylation (T145 et T255) dont les mutations n’ont aucun effet sur l’activité G6Pase dans des cellules fibroblastiques. L’analyse nanoLC-MS/MS a permis l’identification de deux protéines dans l’immunoprécipitat dont la G6PC. Cette dernière a été détectée dans la région de 30–40KDa, ce qui est cohérent avec sa masse attendue. Quatre peptides de la G6PC ont été identifiés (un cytoplasmique, deux transmembranaires et un dans la lumière du RE). Ces résultats doivent encore être complétés pour permettre d’identifier les sites de phosphorylation.

Discussion

La mutagénèse dirigée n’a pas permis de mettre en évidence de site de phosphorylation. Cependant, nous montrons pour la première fois une technique d’immunoprécipitation enrichissant significativement la sous-unité catalytique de la G6Pase, et permettant ainsi sa détection par MS. Cette technique ouvre enfin la voie à l’étude approfondie de la G6PC et de ses régulations. Grâce à cela, nous serons capable d’en déterminer par MS les éventuelles phosphorylations et, le cas échéant, de les localiser.