模拟失重对人脐静脉内皮细胞iNOS表达的影响及其转录调控机制研究
摘要
目的:中长期载人航天的失重环境会对机体心血管系统产生不良影响,主要表现为立位耐力下降。航天医学研究结果表明,几乎所有的航天员在飞行后都出现不同程度的立位耐力降低,严重影响航天员的健康及航天任务的完成。虽经几十年的大量研究,仍然不能圆满解释这种心血管机能失调的确切发生机制。目前,越来越多的工作表明,失重后立位耐力不良的发生可能与血管内皮细胞功能紊乱及其分泌异常有关。本研究以人脐静脉内皮细胞为研究对象,旨在探讨在模拟失重环境下,人脐静脉内皮细胞系HUVEC-C iNOS异常表达的变化及其分子机制。 方法:HUVEC-C细胞以每片1×105个细胞的密度接种于盖玻片上,随机分为NF-κB特异阻断剂PDTC组,AP-1特异阻断剂SP600125组,过表达AP-1组及其相应空白对照组,根据不同处理,细胞又设模拟失重组,静止1G对照组及垂直旋转1G对照组。细胞在不同重力下培养24 h后,提取细胞总RNA,反转录PCR法检测不同处理后iNOS mRNA表达的变化;提取细胞总蛋白,Western-blot法检测iNOS蛋白表达的变化;细胞转染含有7233 bp的iNOS启动子荧光素酶报告基因系统,双荧光法检测iNOS在转录水平的激活情况;细胞转染pNF-κB—luc及pAP-1-luc,双荧光法检测模拟失重后内皮细胞NF-κB和AP-1的转录活性。 结果:①地面静止对照组与垂直旋转对照组iNOS mRNA及蛋白表达均较低,而24 h回转器模拟失重后,HUVEC-C iNOS mRNA及蛋白表达量显著增高;转染了phiNOS(7.2)Luc的HUVEC-C在模拟失重24 h后,荧光素酶相对活性约为1G对照组的2.29倍;②回转器模拟失重24 h后,转染了pNF-κB-lue及pAP-1-1uc的内皮细胞荧光素酶相对活性分别为1G对照组的52%及62%:③应用50μM NF-κB阻断剂PDTC后模拟失重24h,HUVEC-C iNOS mRNA、蛋白表达及转染荧光素酶启动子报告基因的相对荧光量与单纯模拟失重组相比未见显著变化;应用20 μMAP-1特异阻断剂SP600125后与单纯模拟失重组相比,HUVEC-C iNOS mRNA、蛋白及转染了phiNOS(7.2)Luc的相对荧光量均出现显著升高,而过表达AP-1后,与单纯模拟失重组相比HUVEC-C iNOS mRNA、蛋白表达及相对荧光活性均出现明显抑制。 结论:模拟失重24 h可致HUVEC-C iNOSmRNA、蛋白表达显著增高及在转录水平被激活,模拟失重24 h导致的HUVEC-C iNOS异常表达部分地与转录因子AP-1的转录活性降低有关,而与NF-κB的活性降低无关。