Pseudomonas putida GM6中多聚磷酸盐激酶基因(ppk)的克隆及表达
摘要
强化生物除磷工艺(Enhanced biological phosphorus removal,EBPR)的广泛应用,对于削减磷素排放,控制水体富营养化起着十分重要的作用.强化生物除磷最重要的机制是聚磷菌对磷酸盐的贪婪吸收作用(luxury uptake),即聚磷菌吸收的磷素远远高于细菌正常生长所需的磷素需求,产生富磷污泥,其磷含量高达4-7%,最高可达15%,因此排除富磷的剩余污泥即可达到去除水中磷素营养的目的.目前国家颁发的≤城镇污水处理厂污染物排放标准≥(GB18918-2002)对出水氮磷已有明确的要求,因此无论是新建污水处理厂的设计,还是老厂的升级改造都优先考虑强化生物除磷工艺.本文以本实验室自行分离的高效聚磷菌Pseudomonas putida GM6为材料,对聚磷特性、生物除磷关键酶即多聚磷酸盐激酶基因(ppk)的克隆表达进行了深入研究,以期为高效聚磷菌种选育提供理论依据,同时也为EBPR工艺的快速启动与稳定运行提供技术支持.Pseudomonas putida GM6在合成废水中的最适生长条件为pH6-8和20-33℃.生物除磷时最适pH为6.5-7,当pH值小于5.5或大于7.5时除磷能力显著下降;最适温度为20-27℃,当温度大于30℃或小于10℃时,除磷效果明显变差.GM6菌株在合成废水、MOPS培养基、LB培养基及YG培养基中磷的去除率达63%-96.6%,而对照菌E. coli的磷去除率仅在13.6%-30.8%之间.GM6在合成废水中具有明显的厌氧放磷和好氧释磷反应,其厌氧放磷量和好氧吸磷量分别达9 mg L-1和14.24 mg L-1.在历时2小时的厌氧释磷过程中,随着乙酸浓度的下降,游离磷酸根浓度持续上升,符合生物除磷的理论模型.为了进一步阐明生物聚磷的分子生物学机制,我们对ppk基因的克隆表达进行了深入研究.首先根据ppk基因的保守区段设计引物,从GM6的总DNA中扩增到ppk基因上528bp的片段,随后采用本实验室设计的SEFA-PCR技术扩增该片段的上、下游基因序列.将Pseudomonas putida GM6 ppk部分基因及上下游基因序列拼接后采用Omiga软件对测序的基因片段及翻译的蛋白序列分析,结果表明GM菌株的ppk基因全长为2220bp(GenBank accession number DQ133537),其上游为HemB基因,下游为不完整的PPX基因.然后经PCR扩增获得全长序列,并构建多聚磷酸盐激酶基因表达菌株E. coli BL21(DE3)/ pET29a-ppk,经IPTG诱导后3h其表达产物的分子量约为81 kDa,该表达菌株培养12h时磷去除率高达80%,表明ppk基因在E. coli中获得过量表达,导致了E. coli菌体中poly-P的大量聚集,从而使得培养基中的磷酸盐大量的去除.