H_2S在缺血再灌注损伤中神经细胞自噬发生机制中的作用研究

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	作者：肖雁 ; 黄赟 ; 刘雨霞 ; 田茂 ; 齐晓岚 ; 禹文峰 ; 官志忠 关键词：H_2S ; 自噬 ; CBS ; p-Akt/Akt ; p-mTOR/mTOR ; NF-κBp65 ; COX-2 中文刊名：ZJKB 英文刊名：Acta Neuropharmacologica 机构：贵州医科大学附属医院病理科;地方病与少数民族疾病贵州医科大学教育部重点实验室;贵州省医学分子生物学重点实验室贵州医科大学; 出版日期：2018-04-26 出版单位：神经药理学报 年：2018 期：v.8;No.50 语种：中文; 页：ZJKB201802016 页数：2 CN：02 ISSN：13-1404/R 分类号：38-39

摘要

目的:利用siRNA干扰技术干扰H_2S生成的关键酶胱硫醚β-合成酶(cystathionineβ-synthase,CBS)基因并构建细胞氧糖剥夺再灌注(oxygen-glucose deprivation/reperfusion,OGD/R)模型,探讨OGD/R和CBS基因干扰后SH-SY5Y细胞自噬和凋亡情况及相关信号通路变化。方法:构建OGD/R模型,体外模拟缺血再灌注过程,根据氧糖剥夺和再灌注时间不同共设9组,利用透射电镜观察各组细胞OGD/R后细胞内自噬小体形成情况,根据透射电镜结果选取氧糖剥夺4 h/再灌注24 h作为后续实验的OGD/R模型;脂质体转染法将针对CBS基因的siRNA转入SH-SY5Y细胞内,同时构建OGD/R模型,将细胞分为3个组,分别为CBS干扰组,OGD/R组和CBS干扰+OGD/R组,各组均设相应对照。Real time PCR和蛋白印迹法鉴定CBS基因干扰效率,并检测各组自噬相关蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1和信号通路中Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR的蛋白表达水平,以及凋亡信号通路中NF-κBp65、COX-2蛋白表达水平;流式细胞术检测各组细胞凋亡水平。结果:透射电镜观察细胞内自噬小体:除正常对照组和氧糖剥夺4 h/再灌注12 h组未观察到自噬小体外,其余各组均在胞质内观察到了较多自噬小体。CBS基因干扰效率达80%。CBS干扰组自噬相关蛋白及相关信号通路蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ,Beclin-1,p-Akt/Akt,p-mTOR/mTOR蛋白表达水平与阴性对照组比较均无统计学差异;OGD/R组与正常对照组比较,OGD/R组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ明显高于正常对照组,p-Akt/Akt和p-mTOR/mTOR均明显降低,NF-κBp65、COX-2蛋白表达水平均高于正常对照组;CBS干扰+OGD/R组与对照组比较,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ,Beclin-1,p-Akt/Akt,p-mTOR/mTOR均无显著差异。CBS干扰组细胞凋亡率与阴性对照组比较无统计学差异;与正常对照组比较OGD/R组细胞凋亡率明显高于正常对照组;CBS干扰+OGD/R组与阴性对照组比较,细胞凋亡率无显著差异。结论:OGD/R能够明显诱导SH-SY5Y细胞发生自噬和凋亡,且可能与Akt/mTOR及NF-κBp65/COX-2信号通路相关;CBS基因干扰后对细胞自噬和凋亡均无明显影响。
        

引文