猪EAAT3通过激活mTOR信号通路调控氨基酸转运和促进肠上皮细胞增殖

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• 论文作者：叶金玲 ; 高春起 ; 黎相广 ; 金成龙 ; 王丹 ; 严会超 ; 王修启
• 年：2016
• 作者机构：华南农业大学动物科学学院国家生猪种业工程技术研究中心;
• 论文关键词：EAAT3 ; 谷氨酸 ; mTOR ; 氨基酸转运 ; 细胞增殖
• 会议召开时间：2016-10-21
• 会议录名称：中国畜牧兽医学会动物营养学分会第十二次动物营养学术研讨会论文集
• 语种：中文
• 分类号：S828
• 学会代码：ZGXJ
• 会议名称：中国畜牧兽医学会动物营养学分会第十二次动物营养学术研讨会
• 会议地点：中国湖北武汉
• 主办单位：中国畜牧兽医学会动物营养学分会
• 学会名称：中国畜牧兽医学会
• 页数：1
• 文件大小：58k
• 原文格式：O
• 会议级别：全国

摘要

本试验旨在探讨EAAT3对猪肠上皮细胞系IPEC-J2(porcine jejunal epithelial cell line)细胞氨基酸转运和细胞增殖的影响,为开展谷氨酸感应转运的研究奠定基础。试验采用PCR扩增技术,克隆得到长白猪EAAT3 cDNA序列并构建过表达载体,获得EAAT3过表达的IPECJ2稳转细胞株。在此基础上,设计并合成EAAT3 RNA干扰序列,对IPEC-J2细胞中的EAAT3进行RNA干扰。利用全自动氨基酸分析仪检测EAAT3对游离氨基酸转运的影响;应用MTT和细胞计数检测EAAT3对IPEC-J2细胞增殖的影响;采用real-time PCR和Western blot技术,分析EAAT3对mTOR信号通路关键蛋白表达水平的影响。结果表明:1)同源性克隆得到长度为1 575 bp的猪EAAT3 cDNA片段,成功构建过表达载体EAAT3-pcDNA3.1~+,筛选获得EAAT3过表达的稳转细胞株;通过real-time PCR技术检测3条干扰片段的干扰效率获取最佳干扰序列siRNA-003,并且结合Western blot技术检测获取最佳干扰序列siRNA-003的最佳干扰时间点为48 h。2)EAAT3在调节酸性氨基酸转运的同时过表达后可以显著促进胱氨酸的转运,并且RNA干扰后可以显著抑制胱氨酸的转运(P<0.05)。3)EAAT3过表达后可以显著提高IPEC-J2细胞的增殖能力(P<0.05)。4)EAAT3过表达后可以显著上调mTOR信号通路关键蛋白的表达水平,并且RNA干扰后可以显著下调mTOR信号通路关键蛋白的表达水平(P<0.05)。5)EAAT3过表达后可以显著上调谷氨酸/胱氨酸转运载体xCT及其转录因子ATF4的表达水平,并且RNA干扰后可以显著下调xCT及其转录因子ATF4的表达水平(P<0.05)。结果提示:猪EAAT3通过转运谷氨酸激活mTOR信号通路进而促进肠上皮细胞增殖;为了维持谷氨酸代谢池的稳态,mTOR信号通路被激活后可以协同调控转录因子ATF4和谷氨酸/胱氨酸转运载体xCT,将胞内谷氨酸转运到胞外同时交换胞外的胱氨酸转运到胞内。

引文