沙门氏菌间接ELISA抗体检测方法的建立

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• 论文作者：方一臻 ; 范红结
• 年：2016
• 作者机构：南京农业大学动物医学院;
• 会议召开时间：2016-07-20
• 会议录名称：中国畜牧兽医学会兽医公共卫生学分会第五次学术研讨会论文集
• 语种：中文
• 分类号：S855.1
• 学会代码：SYGW
• 会议名称：中国畜牧兽医学会兽医公共卫生学分会第五次学术研讨会
• 会议地点：中国内蒙古通辽
• 主办单位：中国畜牧兽医学会兽医公共卫生学分会
• 学会名称：中国畜牧兽医学会兽医公共卫生学分会
• 页数：2
• 文件大小：465k
• 原文格式：D
• 会议级别：全国

摘要

沙门氏菌(Salmonella)是一类重要的肠道致病菌,会导致动物的腹泻、肠炎、败血症及母畜流产,同时也会感染人,对畜禽养殖及公共卫生意义重大。沙门氏菌包含肠道沙门氏菌和邦戈尔沙门氏菌2个种,以及7个亚种和2500多种血清型,我国已报道其中的292种血清型,绝大多数都具有致病性。种类繁多的血清型给沙门氏菌病的诊断和防控带来很大难度。现有的沙门氏菌抗体检测方法在效果上不甚满意,因此挖掘诊断靶点、建立新型诊断技术对该病的防治很有必要。本研究通过生物信息学比对和后期试验验证,发现外膜蛋白Pag C广泛存在于沙门氏菌各血清型中,在沙门氏菌属属内高度保守、属间特异,确定其适合作为沙门氏菌诊断抗原建立间接ELISA抗体检测方法。将去除信号肽序列的pag C基因克隆至原核表达载体p ET-28a中,成功构建重组表达质粒p ET-28a-pag C,并转化至大肠杆菌BL21中,经IPTG诱导得到重组蛋白Pag C,用凝胶过滤和亲和层析先后对其进行纯化。以纯化的重组蛋白Pag C作为检测抗原建立间接ELISA方法,对该方法的各项反应条件进行了优化。确定ELISA最佳条件为:包被抗原浓度为2μg/m L,待检血清稀释度为1:50,最佳封闭液是5%脱脂奶粉,待检血清作用时间是60 min,HRP标记抗鸡二抗的稀释度是1:1000,二抗作用时间是60 min。经试验验证,建立的方法具有特异性强、重复性好,对主要血清型沙门氏菌均适用等特点。该ELISA方法与Biochek公司的猪沙门氏菌抗体检测试剂盒符合率为83%,与鸡白痢鸡伤寒玻板凝集试验方法符合率为80.6%,与人工感染制备得到的29份鸡白痢标准阳性血清、31份标准阴性血清结果比较符合率为98.3%。用该方法对482份猪临床血清进行检测,总体阳性率为46.7%,感染主要以母猪和种公猪为主;对252份鸡临床血清进行检测,总体阳性率为42.9%。

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