云南结核分枝杆菌临床分离株的基因分型和耐药谱研究

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• 论文作者：池水晶 ; 柳爱华 ; 宝福凯
• 年：2014
• 作者机构：昆明医科大学热带医学研究所;昆明医科大学生物化学与分子生物学系;昆明医科大学病原生物学与免疫学系;云南省高校热带传染病重点实验室;云南省公共卫生与疾病防控协同创新中心;
• 论文关键词：结核分枝杆菌 ; 基因分型 ; 多位点可变数目串联重复序列分析 ; 间隔区寡核苷酸分型 ; 结核分枝杆菌北京家族
• 会议召开时间：2014-09-13
• 会议录名称：纪念中国微生物学会临床微生物学专业委员会成立五周年-第五届中国临床微生物学大会暨台湾海峡两岸微生物学与免疫学论坛论文汇编
• 语种：中文
• 分类号：R440
• 学会代码：WSWZ
• 会议名称：纪念中国微生物学会临床微生物学专业委员会成立五周年-第五届中国临床微生物学大会暨台湾海峡两岸微生物学与免疫学论坛
• 会议地点：中国浙江宁波
• 主办单位：中国微生物学会临床微生物学专业委员会、医学参考报社、宁波大学医学院附属医院
• 学会名称：中国微生物学会临床微生物学专业委员会
• 页数：2
• 文件大小：122k
• 原文格式：O
• 会议级别：全国

摘要

目的通过收集并培养云南省300份结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)临床分离株,在药敏试验基础上,用近年来国际通用的多位点可变数目串联重复序列分析(Multilocus variable-number tandem-repeat analysis,MLVA)和间隔区寡核苷酸分型(Spoligotyping)两种基因分型方法对其中的部分菌种进行基因分型,建立云南区域性MTB临床分离株基因型资源库,明确云南结核病(tuberculosis,TB)患者MTB临床分离株的型别,探索其型别与耐药的相关性,为云南省TB预防、治疗、分子流行病学监测提供科学依据。方法1.选取2013年7月~2013年12月5个月里昆明市第三人民医院门诊、病区所接收的云南省TB患者送检的临床标本,通过MTB培养为阳性、经菌型鉴定为MTB的菌株共300株。采用目前国际市场上通用的BD BACTECTM MGITTM 960全自动快速MTB培养仪进行药敏实验。2.酚-氯仿-异戊醇法提取MTB的DNA。分别采用15个数目可变串联重复序列(Variable number of tandem repeats,VNTR)的MLVA分型技术和Spoligotyping基因分型方法对临床分离株进行基因分型研究,同时应用BioNumerics 5.0软件对分型结果进行聚类分析,并将Spoligotyping聚类结果与SpolDB 4.0数据序列进行比对。3.采用SPSS 17.0统计学软件、卡方检验(x 2test)分析云南地区基因型别与菌株耐药性之间的关系,从而探讨该地区菌株型别的流行传播机制。当P<0.05时,差异有统计学意义。结果1.云南2013年结核患者总体耐药率为36.00%(108/300)。2.云南总体耐多药结核(multi-drug-resistant tuberculosis,MDR)率[至少同时耐异烟肼(Isoniazid,INH)、利福平(Rifampin,RIF)]为19.00%(57/300)。3.云南五种抗结核药的耐药率顺位:INH[27.67%(83/300)],RIF[20.33%(61/300)],PZA(Pyrazinamide)[17.33%(52/300)],SM(Streptomycin)[14.33%(43/300),EMB(Ethambut01)[12.00%(36/300)]。4.男性患者:183(61.00%)多于女性患者:117(39.00%)。5.TB患者年龄顺位:21-40岁[126(42.00%)],41-60岁[100(33.33%)],60岁以上[43(14.33%)],0-20岁[31(10.33%)]。6.采用Spoligotyping分型方法对提取DNA成功的270株MTB临床分离株进行基因分型,并将Spoligotyping基因分型结果与SpolDB 4.0数据序列进行比对.270株MTB临床分离株呈现出68个基因型,其中58株菌表现有独特基因型,其余212株菌成簇,成簇率为78.52%(212/227),成簇菌株呈现10个基因型。其中北京家族菌株为主要流行株,所占比率达到73.70%(199/270)。共得到6个家族基因群,其数目顺位为:Beijing>新发现家族(News)>T>MANU2>U>H3。耐药菌株中,各家族基因群耐药率顺位:Beijing>News>T>MANU2>H3≈U,敏感菌株中,各家族基因群敏感率顺位:Beijing>News>T>MANU2>U>H3,但是Spoligotyping分型结果与MTB耐药之间差异无统计学意义(P>0.05),说明本次研究所得到的6个家族基因群型别与MTB耐药之间均无相关性。7.对其中的114株MTB进行MLVA分型,其表现为100个基因型,其基因多态性明显,其中90株表现为独特基因型,其余24株呈现10个不同的簇,成簇率为12.28%。而结合Spoligotyping分型结果显示,114株MTB表现22个基因型,其中21株表现为独特基因型,其余93株呈现2个不同的簇,成簇率为79.82%.比例最大的基因型-北京家族占78.07%(89/114),用MLVA分型技术可将北京家族进一步划分为76个不同的VNTR基因型。由此可见MLVA分辨率明显高于Spoligotyping,但Spoligotyping对北京家族的鉴定更为快速直观。8.114株MTB进行MLVA分型得到的基因型别顺位为Ⅲ群:82.46%(94/114),Ⅰ群:11.40%(13/114),Ⅱ群:3.51%(4/114),Ⅳ群:2.63%(3/114)。云南省Ⅲ群基因型所患TB比例最大,值得重视。Beijing家族集中在MLVA基因型别的Ⅲ群基因型中,Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ群基因型呈现明显多态性,北京家族呈现零分布。因此云南省应加强对MLVA分型中Ⅲ群的防范。9.通过总汉高指数计算公式求得15位点VNTR总HGDI是97.05%。通过http://www.hpa-bioinfotools.org.uk/cgi-bin/DICI/DICI.pl生物学网站得知114株MTB临床分离株的高、中、低分辨力位点的汉高指数分别为:高分辨力位点为:MIRU26、ETRA、ETRE、Mtub21,中分辨力位点为:MIRU10、MIRU40、Mtub39、MIRU39、Mtub30,低分辨力位点为:ETRB、ETRD、ETRC、MIRU16、MIRU23、MIRU27。结论1.云南地区MTB耐药情况严峻。2.云南地区MTB临床分离株存在明显的基因多态性,且北京家族为该地区的主要流行株。3.云南地区北京家族菌株为主要流行株,但是北京家族、非北京家族菌株与耐药之间,差异无统计学意义(P>0.05),因此未能证明北京家族、非北京家族菌株在该地区的流行传播与耐药相关。4.云南省MTB中以Ⅲ群基因型别所占比例最大,MLVA基因型别与耐药之间,差异无统计学意义(P>0.05),因此未能证明MLVA基因型别在该地区的流行传播与耐药相关。5.MLVA和Spoligotyping联合应用,对MTB进行株水平鉴定的能力明显增强。

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