米曲霉L-苹果酸胞质途径重建和转运调控研究
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摘要
L-苹果酸在食品、医药、化工、建材等领域具有广泛的用途,被美国能源部列为12个"高附加值生物基化学品"之一。本研究以一株米曲霉为出发菌株,通过重构L-苹果酸的胞质合成途径和强化产物转运途径,显著提升了L-苹果酸的合成效率。首先,通过过表达还原TCA途径中的丙酮酸羧化酶和苹果酸脱氢酶,L-苹果酸的摇瓶产量由26.1 gL~(-1)提高至42.3 gL~(-1)。其次,为了提高L-苹果酸的前体-草酰乙酸的合成,本研究在米曲霉胞质内异源构建了大肠杆菌的磷酸烯醇式丙酮酸到草酰乙酸的回补途径,L-苹果酸产量提高至58.5 gL~(-1)。L-苹果酸的高生产强度需要结合高效的转运机制,通过共同过表达米曲霉四碳酸转运蛋白和粟酒劣质酵母的苹果酸转运子,L-苹果酸的产量显著提高至89.5 gL~(-1)。最后,通过对米曲霉内苹果酸合成的主代谢流的转录分析和比较,发现了苹果酸合成的潜在限速酶-6-磷酸果糖激酶,解除该反馈抑制后,L-苹果酸的摇瓶产量提高至93.2 gL~(-1)。
引文