变异链球菌clpP基因缺陷株的构建与鉴定

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• 论文作者：张加勤 ; 黄珊珊 ; 洪国粦
• 年：2016
• 作者机构：厦门大学附属第一医院检验科;
• 论文关键词：变异链球菌 ; clpP基因 ; 应激耐受MicroScanWalkAway仪器对碳青霉烯类耐药
• 会议召开时间：2016-09-09
• 会议录名称：第七届中国临床微生物学大会暨微生物学与免疫学论坛论文汇编
• 语种：中文
• 分类号：R440
• 学会代码：WSWZ
• 会议名称：第七届中国临床微生物学大会暨微生物学与免疫学论坛
• 会议地点：中国浙江宁波
• 主办单位：中国微生物学会临床微生物学专业委员会、医学参考报社、宁波大学、宁波大学医学院附属医院
• 学会名称：中国微生物学会临床微生物学专业委员会
• 页数：1
• 文件大小：58k
• 原文格式：O
• 会议级别：全国

摘要

目的变异链球菌(Streptococcus mutans,S.mutans)是人类口腔的主要致龋菌之一。除了可引起龋齿之外,还可引起牙髓病、牙周病、感染性心内膜炎等,严重影响人们的健康和生活质量。ClpP蛋白酶参与调节生物体蛋白质代谢过程,在清除不可逆损伤蛋白质、对外应激耐受及维持内环境稳态等生物过程中发挥重要作用。然而,变异链球菌clpP基因功能及其表达调控机制尚未阐明。为研究变异链球菌clpP基因的功能,本文利用CreloxP同源重组的方法构建变异链球菌ClpP基因缺陷株的构建并进行初步鉴定。方法(1)设计引物两端加入loxP位点,以质粒pIB107为模版,PCR扩增KamR基因片段,利用Qiagen PCR production Kit进行纯化,回收lox71-KamR-lox66基因片段;(2)以S.mutans UA159为模版,PCR扩增clpP基因片段,插入pMD-20T载体,得到pMD-clpP克隆质粒;(3)EcoRI/BamHI酶切pMD-clpP克隆质粒,Qiagen Gel Extration Kit回收大片段,与lox71-KamR-lox66基因片段建立连接体系,转化E.coli DH5,使用KAN抗性LB平板筛选,限制性内切酶EcoRI/BamHI酶切和PCR扩增鉴定,得到同源重组组质粒pDclpP;(4)XhoL线性化pDclpP质粒,借助感受刺激多肽(competence-stimulating peptide,CSP),将线性化的pDclpP质粒转化S.mutans UA159,KAN抗性THY Agar平板30℃过夜筛选,挑取阳性克隆PCR鉴定,得到clpXP::kan株;(5)CSP转化热度敏感质粒pCrePA,30℃培养删除抗性基因,再转37℃培养剔除pCrePA质粒,获得变异链球菌clpP突变株,PCR鉴定;(6)提取变异链球菌及其clpP突变株总RNA,42℃逆转录为cDNA,RT PCR鉴定变异链球菌clpP的表达情况。结果(1)同源性比对结果证实,与同属基因组低G+C含量的枯草杆菌相似,变异链球菌亦存在ClpP蛋白酶,其编码基因clpP(SMU_1672)591bp,位于S.mutans UA159基因组第1587236 bp~1587826 bp,与枯草芽孢杆菌clpP基因同源性高达93.9%,其编码产物为21.5kDa的多肽分子,与枯草芽孢杆菌ClpP蛋白具有83.8%的同源性;(2)经PCR、酶切及DNA测序验证,成功构建同源重组质粒pDclpP;(3)PCR结果证实成功在变异链球菌中敲除clpP基因;(4)RT PCR结果证实变异链球菌clpP突变株中无clpP基因表达产物。结论成功构建变异链球菌中clpP基因缺失突变株。

引文