幽门螺杆菌鞭毛基因fliD、flaA、flaB、flgK、flgL、flgE的测序与鞭毛基因位点突变的发现
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- 论文作者：谷海瀛 ; 叶丽娜 ; 李央央 ; 王苗苗
- 年：2015
- 作者机构：宁波大学医学院;
- 论文关键词：幽门螺杆菌 ; 鞭毛基因 ; 测序 ; 分型
- 会议召开时间：2015-09-03
- 会议录名称：第六届中国临床微生物学大会暨微生物学与免疫学论坛论文汇编
- 语种：中文
- 分类号：R440
- 学会代码：WSWZ
- 会议名称：第六届中国临床微生物学大会暨微生物学与免疫学论坛
- 会议地点：中国湖南长沙
- 主办单位：中国微生物学会临床微生物学专业委员会、医学参考报社、宁波大学医学院附属医院
- 学会名称：中国微生物学会临床微生物学专业委员会
- 页数：2
- 文件大小：140k
- 原文格式：O
- 会议级别：全国
摘要
目的幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)是微需氧、革兰阴性、有鞭毛、螺旋杆菌,其鞭毛是重要的致病因子。因为与人体胃肠粘膜细胞相互作用的是位于鞭毛外部的蛋白,而鞭毛的外部主要是由鞭毛基因fliD、flaA、flaB、flgK、flgL、flgE编码的蛋白质构成,目前,在已发表的文献中未见对从临床标本分离的H.pylori的6个鞭毛基因同时进行测序,所以本研究通过分析这6个鞭毛基因,从分子水平寻找H.pylori鞭毛基因分型的标记物,并预测鞭毛基因位点突变的存在。方法 1.复苏H.pylori标本,包括质控菌株ATCC700392(H.pylori 26695)和114个临床标本。利用倍比稀释的方法培养出单菌落再进行传代,经脲酶试验、触酶试验、氧化酶试验、抗原试验、镜下形态观察等鉴定为纯的H.pylori。2.用细菌DNA核酸提取试剂盒提取H.pylori,并用超微量分光光度计进行核酸浓度测定。3.从NCBI数据库下载H.pylori不同菌株的6个鞭毛基因序列,分别进行比对,依据高保守区序列设计引物,采用高保真聚合酶链反应(PCR)分别扩增6个基因,切胶、回收、纯化目的基因,使用ABI3730XL测序仪测序,获得目的基因序列。4.使用clustalw 5.05软件将114个H.pylori标本中的6个基因序列分别进行两两比对,得到各个标本各个基因间的SNP矩阵。利用perl脚本将所有基因SNP矩阵进行合并,或者将每个基因在114个标本中的SNP矩阵进行合并,然后利用mega2.1软件中最小进化法构建相应的系统进化树。5.根据测序结果,利用GeneDoc软件,将114个标本6个鞭毛基因的核苷酸序列分别与Hpylori26695菌株中的相应基因的核苷酸序列进行同源性比对。6.根据每个标本基因序列预测蛋白质信息,包括分子质量大小、氨基酸数、等电点、不稳定指数、亲水性等。结果 1.测序结果证实:本研究中所测得的质控菌株ATCC700392(H.pylori 26695)的6个鞭毛基因的核苷酸序列与Genbank上已经公布的序列一致,证明本研究测序结果的可靠性。根据114个临床菌株的鞭毛基因测序所得的核苷酸序列得到了相应蛋白的氨基酸序列,并对所推测的蛋白做生物信息学的分析:(1)设计多对引物,PCR扩增出6个鞭毛基因(fliD、flaA、flaB、flgK、flgL、flgE)。将测序得到的目的基因序列,与Hpylori 26695进行同源性比对,fliD基因的同源性为94%~96%,flaA基因的同源性为96%~97%,flaB基因的同源性为95%~97%,flgK基因同源性为95%~98%,figL基因的同源性为94%~95%,flgE基因同源性为90%~100%。(2)预测蛋白质信息,包括分子量大小、氨基酸数、等电点、不稳定指数、亲水性等。不稳定指数<40,为稳定蛋白。亲水值<0,是亲水性蛋白。fliD基因序列全长为2055bp,编码的蛋白质含685个氨基酸。分子量在74.10kD~74.20kD之间。等电点在5.11~5.19之间。不稳定指数在24.93~26.40之间。亲水性在-0.418~-0.406之间。flaA基因序列全长为1530bp,编码的蛋白质含510个氨基酸。分子量在53.18kD~53.32kD之间。等电点在5.10~6.37之间。不稳定指数在26.96~29.10之间。亲水性在-0.17~-0.15之间。flaB基因序列全长为1542bp,编码的蛋白质含514个氨基酸。分子量在53.93kD~53.99kD之间。等电点在5.81~5.95之间。不稳定指数在24.50~26.05之间。亲水性在-0.16~-0.145之间。flgK基因序列全长为1818bp,编码的蛋白质含606个氨基酸。分子量在55.82kD~68.45kD之间。等电点在5.00~11.87之间。不稳定指数在31.20~38.76之间。亲水性在-0.71~0.09之间。flgL基因序列全长为2484bp,编码的蛋白质含828个氨基酸。分子量在91.78kD~92.20kD之间。等电点在5.18~5.38之间。不稳定指数在22.72~25.07之间。亲水性在-0.57~-0.54之间。flgE基因序列全长为2154bp,编码的蛋白质含718个氨基酸。分子量在65.29kD~76.55kD之间。等电点在5.04~10.81之间。不稳定指数在25.53~62.19之间。亲水性在-0.91~0.45之间。2.根据所构建的系统发育树,对114个H.pylori临床标本进行分型:根据鞭毛基因fliD的基因序列,系统发育树提示分为A、B两大类群,其中A群又可分为7个类群,B群分为6型。根据鞭毛基因flaA基因序列分型,系统发育树提示分为A、B两大类群,其中A群又分为C、D两个类群,C群可分为33型,D群可分为22型;B群可分为4型。根据鞭毛基因flaB基因序列分型,系统发育树提示分为A、B两大类群,其中A群又可分为C、D两群,其中C群分为71型,D群分为6型。根据鞭毛基因flgK基因序列分型,系统发育树提示分为A、B两大类群,其中A群又可分为C、D两群,其中C群分为72型。根据鞭毛基因flgL基因序列分型,系统发育树提示分为8个类群。根据鞭毛基因flgE基因序列分型,系统发育树提示分为A、B两大类群,其中A群又可分为C、D两个类群,C群可分为54型,D群可分为2型;B群可分为16型。结论通过Sanger测序,首次同时完成114个H.pylori临床标本中鞭毛基因fliD、flaA、flaB、flgK、flgL、flgE的测序,为深入研究鞭毛的结构功能及H.pylori的致病性打下基础。与H.pylori 26695进行同源性比对发现,其中有2株幽门螺杆菌的flaB基因在第369个碱基位置增加一个碱基,发生移码突变;有6株幽门螺杆菌菌株的flgL基因,在相同位置缺失6个核苷酸碱基;所测所有菌株包括质控菌株ATCC700392(H.pylori 26695)的fliD基因,均与NCBI提交的H.pylori 26695的fliD基因(基因登陆号为:CP003904.1)不同,均在第1962个基因处,比H.pylori26695多一个碱基,发生移码突变,终止密码子位置、氨基酸长度均发生改变。此外,同一个H.pylori菌株的2个不同菌落,也出现了碱基缺失、碱基增加、碱基改变的情况,概率为3/46。这就是鞭毛基因异质性,可能会引起定植的不同。除flgE变异略大外,其余鞭毛基因(fliD、flaA、flaB、flgK、flgL)的核苷酸序列均相对保守,并根据测序结果预测鞭毛蛋白的理化性质,得出鞭毛蛋白稳定性较高,可作为抗原诊断的依据。利用Sanger测序所得的菌株间核苷酸序列的差异,从而达到分型的目的,由于菌株间变异较小,所以分型结果是否与临床疾病相关,有待于进一步研究。
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