人自身抗原SSA52的酵母重组分泌表达及其斑点免疫金渗滤法的建立

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• 论文作者：杨湘越 ; 宋涛 ; 兰小鹏
• 年：2011
• 作者机构：南京军区福州总医院解放军临床检验医学研究所;
• 会议召开时间：2011-09-27
• 会议录名称：第二届中国临床微生物学大会暨微生物学与免疫学三江论坛论文汇编
• 语种：中文
• 分类号：R446.6
• 学会代码：WSWZ
• 会议名称：第二届中国临床微生物学大会暨微生物学与免疫学三江论坛
• 会议地点：中国浙江宁波
• 主办单位：中国微生物学会临床微生物学专业委员会
• 学会名称：中国微生物学会临床微生物学专业委员会
• 页数：1
• 文件大小：46k
• 原文格式：O
• 会议级别：全国

摘要

人自身抗原SSA52通常采用组织提取法或原核表达获得,存在诸多问题。本研究通过基因克隆技术,在毕赤酵母中表达人自身抗原SSA52,并建立斑点免疫金渗滤法。采用RT-PCR扩增SSA52基因,与酵母表达载体pPIC9k重组,构建表达质粒pPIC9kSSA52。用电穿孔法转化酵母菌SMD1 168,在MD平板上筛选重组克隆,用G418快速筛选高拷贝转化子,阳性克隆经甲醇诱导表达后,培养上清液用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹法(western blot,WB)鉴定,并建立斑点免疫金渗滤法(dot immuogold filtration assay,DIGFA),进行初步临床应用对比研究。结果显示RT-PCR产物约为1400 bp,与预期1428 bp接近,pPIC9k-SSA52重组阳性克隆测序结果与基因库核酸数据库报道完全一致,双酶切鉴定正确,表达产物SSA52的相对分子质量约52 000,WB法证实表达产物具有天然SSA52分子的免疫原性,阴性对照菌未见目的表达条带。DIGFA与欧蒙酶免疫斑点法的阳性符合率为95.2%(120/126),阴性符合率为94.0%(47/50),总符合率为94.9%(167/176);2种方法检测结果无统计学显著差异(P>0.05)。说明SSA52在毕赤酵母中分泌表达成功,建立的DIGFA简便、快速、准确。

引文