胸膜肺炎放线杆菌血清7型apxⅡC-/apxⅠA+、ureC-/apxⅢ+减毒双突变菌株的构建及特性研究
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- 论文作者：崔国林 ; 郭芳芳 ; 陈小玲 ; 杨兵 ; 周宏专 ; 苏霞 ; 徐福洲
- 年：2016
- 作者机构：北京市农林科学院畜牧兽医研究所畜禽疫病防控技术北京市重点实验室;
- 论文关键词：胸膜肺炎放线杆菌 ; Apx毒素 ; 尿素酶 ; 突变 ; 毒力
- 会议召开时间：2016-09-18
- 会议录名称：第六届中国兽药大会论文集
- 英文会议录名称：Proceedings of 2016 the 6th China Congress of Veterinary Medicine
- 语种：中文
- 分类号：S852.61
- 学会代码：ZGXJ
- 会议名称：第六届中国兽药大会
- 会议地点：中国四川成都
- 主办单位：中国兽医药品监察所、中国兽药协会
- 学会名称：中国畜牧兽医学会
- 页数：2
- 文件大小：147k
- 原文格式：O
- 会议级别：全国
摘要
胸膜肺炎放线杆菌(APP)是引起猪传染性胸膜肺炎的呼吸道病原细菌,其中Apx毒素和尿素酶(Urease)均是其主要的毒力因子,且Apx毒素又是其主要的免疫原性蛋白。为构建APP减毒突变菌株,本试验首先利用仅表达ApxⅡ毒素的APP血清7型参考菌株(WF83),缺失apxⅡC基因片段并插入具有免疫原性的apxⅠA-N基因片段,利用sacB基因负向筛选系统构建无抗生素抗性基因标记的apxⅡC-/apxⅠA+单突变菌株(GS7C);在单突变菌株GS7C构建成功的基础上进一步缺失基因组中ureC基因片段,并插入具有免疫原性的apxⅢ-N基因片段,进而再利用sacB基因负向筛选系统构建成功表达ApxⅢ-N蛋白的apxⅡC-/apxⅠA+、ureC-/apxⅢ+双突变菌株(GS7CA)。该双突变菌株生物学特性鉴定结果显示,双基因突变不影响细菌增殖能力;溶血活性和尿素酶活性完全丧失;Western blot鉴定结果显示可表达ApxⅡ蛋白及插入的外源基因ApxⅢ-N蛋白,但未表达插入的ApxⅠA-N蛋白;连续传代基因组中插入的外源基因apxⅠA-N和apxⅢ-N基因片段均可稳定遗传;母源菌株APP7和突变菌株(GS7C和GS7CA)对小鼠攻毒试验结果显示,突变菌株GS7C和GS7CA对小鼠毒力的LD50值较母源菌株APP7分别增加5.2倍和9.2倍,提示单突变和双突变菌株对小鼠的毒力较母源菌株均显著降低;对断奶仔猪攻毒试验显示双突变菌株GS7CA对仔猪肺脏的损伤指数较母源菌株显著降低;利用双突变菌株GS7CA作为弱毒活疫苗对仔猪进行鼻腔接种免疫,免疫两次后利用APP血清1、2、7型参考菌株进行攻毒,攻毒后通过每组死亡数和肺损伤指数的差异进行比较结果显示,免疫组在仔猪死亡数、临床症状、肺损伤指数等方面较非免疫对照组均显著降低,提示GS7CA作为弱毒活疫苗具有一定的攻毒保护效果。本试验结果提示构建的APP双突变菌株具有发展成为APP减毒活疫苗的潜力,为研制具有交叉保护活性的APP基因工程减毒活疫苗奠定了基础。
引文