用高灵敏度质谱仪检测大鼠尿中利尿剂阿佐噻米7个新代谢物
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摘要
研究目的:阿佐噻米(2-chloro-5-(2H-tetrazol-5-y1)-4-(、(2-thiophenylmethyl)amino)benzenesulfonamide)是一种髓襻利尿药,作用类似呋塞米,主要用于治疗水肿和高血压等疾病。因其显著的利尿作用,有可能被运动员滥用,以达到迅速减轻体重,参加低重量级别比赛的目的,或用于掩蔽其他禁用物质的使用。全面研究阿佐噻米的代谢产物,使我们能够更加清楚的了解阿佐噻米的代谢规律,延长检测窗口期以防漏检。本研究使用高分辨率和高灵敏度的质谱仪检测服用阿佐噻米后大鼠尿中新的微量代谢物,并对其结构进行解析和鉴定。研究方法:对10只成年SD大鼠(250-300g左右)进行10mg/kg剂量口服受试实验,采集给药前后大鼠的尿样,置于-80℃冰箱中冷冻保存。采用固相萃取方式对空白和给药后的大鼠尿样进行前处理,并用200uL、50%的甲醇/水溶液进行定溶。使用赛默飞Dionex Ultimate3000 RSLC高压液相-Q Exctive Plus质谱仪和Agilent Zorbax XDB-C18色谱柱(2.1mm×50mm×3.5μm)对上述样品进行检测。液相色谱流动相为pH 3.5的10 mM甲酸铵缓冲液(A)和乙腈(B)。质谱数据采集使用正、负离子同时全扫描和二级质谱扫描结合模式。通过解析阿佐噻米药物原型及代谢产物的一级质谱和相应的二级质谱图,推测和鉴定阿佐噻米的代谢产物结构。研究结果:分别用正、负离子采集模式的质谱数据对阿佐噻米代谢物进行结构解析,结果显示负离子模式响应较高,发现的代谢物也较多。对代谢产物的二级质谱进行归属并推测其结构,初步鉴定SD大鼠口服阿佐噻米后,尿样中除药物原形外,还发现9个代谢产物M1-M9。除代谢物M1(4-氨基-2氯-5(1H-四唑基-5)苯磺酰胺)和M2(2-噻吩甲酸)有文献报道外,M3-M9均为本研究首次发现,其结构分别为药物原形或代谢物M1和M2的甲基化、羟基化、氧化还原、氮杂环开环等Ⅰ相产物,还有与葡萄糖醛酸或硫酸结合的Ⅱ相产物。研究结论:本实验使用高灵敏度和高分辨率质谱仪,对阿佐噻米在SD大鼠体内的代谢规律进行了研究,首次发现并鉴定7个新代谢物,为该利尿剂的检测提供了理论依据。目前该方法已经应用于我们实验室兴奋剂样品常规检测中。
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