转基因兔乳腺特异性表达重组人纤溶酶原激活剂(rhPA)及其药效学研究
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摘要
自上世纪以来,血栓性疾病一直是危害人类健康和生命安全的头号因素,溶栓疗法是目前临床上使用最广泛而有效的一种治疗方法,而且溶栓药物已经历了三代发展。重组人纤溶酶原激活剂(rhPA)是一种丝氨酸蛋白酶,能够高效特异地溶解血栓,属的第三代溶栓药物。本研究构建了rhPA乳腺特异性表达载体,应用到转基因兔制备一种新颖、高效的溶栓药物。相关研究方法和结果如下:在获得rhPA表达兔(1mg/mL)以上的基础上,应用3株自制的高效价小鼠单克隆抗体制备亲和层析柱。通过离心脱脂、饱和硫酸铵沉淀、超滤及透析等兔乳前处理,获得粗纯品。将C4株抗体与CNBr activated Bestarose 4FF偶联来制备免疫亲和层析柱。0.75mol/L硫酸铵斗40%丙二醇的TE缓冲液(pH7.9)洗脱获得半纯品。Sephedex75凝胶过滤纯化目标蛋白,获得纯度96%-99%rhPA。与阿替普酶对照品相比,圆二色谱分析显示,该纯化产物与阿替普酶有相似的二级结构;FAPA测定纯化产物rhPA的体外溶栓比活性,其值高达约214倍,远远高于阿替普酶溶栓药。纯品经去内毒素处理后,分别以0.3mL/只小鼠腹腔注射角叉菜胶诱导的尾部血栓小鼠,结果显示以不同的"给药"浓度0.1mg/只剂量组、0.4mg/只剂量组、1.6mg/只剂量组及阿替普酶、生理盐水对照组对小鼠进行溶栓试验,结果显示rhPA各剂量组能有效消除小鼠尾部血栓。结果表明,转基因兔表达产物rhPA能够能够从兔奶中分离纯化出来;纯化产物具有高回收率、高纯度、高生物活性,体内外溶栓试验显示rhPA具有较阿替普酶更好的疗效。同时表明已经建立一套比较完备的转基因动物制药下游技术体,这在国内外尚未见报道,为以后大量生产新型溶栓药物提供了新的思路,也为后期进一步临床试验奠定了基础。
引文