肿瘤细胞释放自噬小体(TRAPs)活化中性粒细胞及其功能研究
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摘要
背景:酵母细胞和哺乳动物细胞内形成的自噬小体能够释放至胞外,称之为分泌型自噬小体(Secretory Autophagosome)。分泌型自噬小体参与IL-1b、IL-18等细胞因子的分泌以及危险相关分子(Danger-associated Molecular Pattern,DAMP)(如HMGB1、ATP等)的释放。本课题组在以往研究中,通过高速离心等方法从多种肿瘤细胞培养上清以及临床肿瘤患者瘤性胸/腹水中成功募集到分泌型自噬小体,我们将其命名为肿瘤细胞释放的自噬小体(Tumor Released Autophagosomes,TRAPs)。课题组前期研究显示,TRAPs能诱导B细胞成为具有免疫抑制功能的调节性B细胞;同时发现,巨噬细胞能有效摄取TRAPs并极化成为M2型巨噬细胞。中性粒细胞是重要的免疫细胞,在肿瘤微环境中,肿瘤细胞和肿瘤相关巨噬细胞通过分泌趋化因子募集中性粒细胞。有研究发现,肿瘤相关中性粒细胞(Tumor-associated Neutrophils,TANs)有两种类型,N1型TANs具有抑制肿瘤生长、转移和杀伤肿瘤等抗肿瘤作用,N2型TANs具有促进肿瘤生长、转移和肿瘤血管生成等促肿瘤形成作用。但是,中性粒细胞能否摄取TRAPs以及在肿瘤微环境中发挥何种调节作用尚不清楚。目的:探讨中性粒细胞能否摄取TRAPs以及活化后中性粒细胞发挥的免疫调节作用。方法:1、提取肿瘤细胞TRAPs;2、密度梯度离心法提纯人外周抗凝血中性粒细胞;3、FACS检测中性粒细胞吞噬TRAPs的情况;4、激光共聚焦显微镜观察中性粒细胞摄取TRAPs;5、用qRT-PCR、ELISA、FACS等方法检测活化后中性粒细胞表型变化及细胞因子分泌水平。结果:通过密度梯度离心法,可获得纯度大于98%的人外周血粒细胞。人中性粒细胞可以摄取TRAPs,FACS结果显示,中性粒细胞吞噬TRAPs(3mg/m L)在3小时左右达到吞噬高峰,吞噬效率约为70%。中性粒细胞与TRAPs共孵育3小时,10 mg/m L的TRAPs可达到饱和吞噬浓度。激光共聚焦显微镜结果进一步证实,TRAPs能被中性粒细胞(CD66b+)摄取。摄取TRAPs后的中性粒细胞TNF-α、CCL2、Arg-1等细胞因子水平发生变化。结论:初步研究表明中性粒细胞能够摄取TRAPs并发挥一定免疫调节作用。
引文