构建羊驼天然重链单域噬菌体抗体库
详细信息 查看官网全文
摘要
研究目的:相比传统抗体,羊驼中存在天然缺失轻链的抗体,称为重链抗体。与具有重链和轻链4条多肽链组成的抗体分子不同,重链抗体由两条同源的重链肽段组成,只包含可变区、CH2区和CH3区。它天然缺失轻链及常规抗体重链中的CH1区,仍具有与普通抗体相当的抗原结合能力。单域重链抗体具有分子量小,易表达,耐高温,高溶于水等性质。噬菌体展示技术将抗体分子展示于噬菌体表面后,利用靶标抗原分子将表达特异性抗体分子的噬菌体筛选出来,通过基因工程的方法对抗体进行表达和后续的功能鉴定,从而获得功能性抗体分子。综合羊驼重链抗体和噬菌体展示抗体库优势,本研究构建大容量天然羊驼重链单域噬菌体抗体库。研究方法:采集未经免疫的羊驼外周血溶于EDTA抗凝剂中,使用淋巴细胞分离试剂盒获得淋巴细胞,分装并取出107个细胞,以TRIzol Reagent试剂提取总RNA,使用随机引物反转录成cDNA。采用巢式PCR法特异性扩增羊驼重链抗体可变区片段,在第一轮PCR中,扩增FR1和CH2之间的片段,使用引物CALL001:5’-GTCCTGGCTCTCTTCTACAAGG-3’和CALL002:5’-GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC-3’;通过琼脂糖凝胶电泳获得重链抗体上600-700bp的片段,从1%核酸胶中分离出600bp和900bp的片段,并以600bp片段为模版进行第二轮扩增,扩增FR1和FR4之间的片段,第二轮扩增引物为VHHFprimer5’CTGGCCCAGGCGGCCGA GGTGCAGCTG(C/G(A/T)G(C/G)A(G/T)TC(G/T)G3’VHHRprimer:5’ACTGGCCGGCCTGGCCTGA GGAGACGGTGATGACC(A/T)GGGTC-3’,(包含Sfil和Not I限制性酶切位点),扩增产物约450-520bp将重链抗体可变区片段与噬菌粒载体p CANTAB5E连接获得重组子,多次电转感受态大肠杆菌TG1后获得VHH抗体基因库,构建羊驼天然重链单域抗体库,并对抗体文库的库容量及多样性进行评估分析,以M13KO7辅助噬菌体感染扩增获得噬菌体展示单域抗体库。实验结果:用梯度稀释法测得该抗体库的库容为10~7。实验结论:本研究成功构建了大容量的羊驼天然重链单域抗体库,鉴定分析其库容量及多样性均良好,为特异性重链抗体的筛选奠定基础。
引文