C型钠肽对牛腔前卵泡体外生长发育作用的研究
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摘要
胚胎工程相关技术的发展提高了卵母细胞的利用效率,改善了雌性动物的生殖性能。然而,目前卵母细胞体外成熟(in vitro maturation,IVM)、体外受精(in vitro fertilization,IVF)等胚胎工程相关技术,只限于从卵巢表面的有腔卵泡中获取卵母细胞,因此其数量非常有限。众所周知,雌性动物的卵巢中含有大量腔前卵泡,如果能成功体外培养动物的腔前卵泡至有腔卵泡阶段,再从这些有腔卵泡中收集卵母细胞,用于体外受精等胚胎工程技术研究与应用,进一步促进这些胚胎工程技术的研发和应用范围。C型钠肽(C-type natriuretic peptide,CNP)是哺乳动物卵泡内天然存在的,钠肽受体2(natriuretic peptide receptor2,NPR2)是其特异性受体。有关CNP的报道大部分集中在其对哺乳动物卵母细胞减数分裂阻滞和体外成熟中的作用,大量研究发现C型钠肽可以维持哺乳动物卵母细胞减数分裂的阻滞,使卵母细胞核成熟和胞质成熟同步化,进而提高卵母细胞的成熟率和后期胚胎的发育能力。最近有研究表明,CNP能促进小鼠腔前卵泡发育。本研究以牛卵巢为试验材料,从牛卵巢上采用刮梳法分离牛腔前卵泡。在基础培养液中添加100 ng/mL CNP或联合添加100 ng/mL FSH和100 ng/mL CNP体外培养150~300μm直径的牛腔前卵泡12 d,结合FSH对牛腔前卵泡体外发育的作用,初步探索CNP对牛腔前卵泡体外生长发育、存活、成腔以及卵泡发育相关基因和凋亡相关基因表达的影响,以期为哺乳动物腔前卵泡的体外培养提供基础。试验研究内容及结果如下:1.从屠宰场收集牛卵巢,分离腔前卵泡,进行体外培养试验。结果显示,基础培养液α-MEM+中体外培养牛腔前卵泡12 d,卵泡存活率达到58.33±4.04%。这一结果为后续研究CNP对牛腔前卵泡体外生长发育的影响提供了可能。2.基础培养液中分别添加FSH、CNP以及FSH+CNP,体外培养牛腔前卵泡12 d,测量其在第0,4,8,12 d的卵泡直径,统计卵泡直径生长变化情况。结果表明,FSH组和α-MEM+组的卵泡,随着培养天数的增加卵泡直径不断增大;CNP组和FSH+CNP组的卵泡直径随着培养天数的增加,呈现递减的趋势,但CNP组和FSH+CNP组牛腔前卵泡体外培养12 d后,卵泡腔形成率显著高于FSH组和α-MEM+组(P<0.05)。从以上结果我们分析,在体外培养条件下CNP可能促进了未充分生长发育的卵泡过早成腔。3.基础培养液中分别添加FSH、CNP以及FSH+CNP,体外培养牛腔前卵泡12 d,统计卵泡存活率。结果显示,FSH+CNP组腔前卵泡存活率显著低于其他三组(α-MEM~+、CNP和FSH组)(P<0.05),而CNP组卵泡存活率显著低于FSH组(P<0.05),略低于α-MEM~+组但差异不显著(P>0.05)。以上研究结果说明CNP可能降低了体外培养牛腔前卵泡存活率。4.利用反转录PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR)技术和实时定量PCR(quantificational real-time PCR,qRT-PCR)技术检测牛腔前卵泡Npr2 mRNA以及发育和凋亡相关基因的表达。结果显示,牛腔前卵泡体外培养12 d,CNP组Npr2 mRNA相对表达量高于其他三组(α-MEM~+、FSH和FSH+CNP组),但差异不显著(P>0.05);发育相关基因FSHR、CYP19A1 mRNA相对表达量随着培养天数的增加,呈现先升高后降低的趋势;而PCNA mRNA相对表达量则逐渐升高;体外培养第12 d,CNP组和FSH+CNP组FSHR、CYP19A1、PCNA mRNA相对表达均低于其他两组(α-MEM~+和FSH组)。凋亡相关基因Bax和Apaf-1 mRNA相对表达量都随着培养天数增加而逐渐增加,FSH+CNP组和CNP组相对表达量均显著高于α-MEM+组和FSH组(P<0.05)。根据以上研究结果,基础培养液添加CNP体外培养牛腔前卵泡12天,卵泡发育相关基因表达降低,而凋亡相关基因表达升高,由此我们推测CNP可能不利于牛腔前卵泡生长以及存活。以上研究结果表明,在体外培养条件下CNP能显著促进牛腔前卵泡成腔。然而,CNP显著降低卵泡存活率,不利于体外培养的牛腔前卵泡生长。因此,CNP在体外培养的牛腔前卵泡中的作用机制有待进一步的试验研究。
引文