更年安怡片对更年期大鼠卵巢细胞凋亡及超微结构影响的实验研究
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摘要
目的：
更年期是人体衰老过程中生理变化非常明显的阶段，是妇女由生育期向老年期过渡的时期。此时，由于卵巢功能逐渐衰退，雌激素水平明显下降，植物神经功能紊乱，患者出现腰膝酸软、潮热汗出、心悸不宁、烦躁易怒或抑郁等症状，统称为更年期综合征。部分进入更年期的妇女不仅出现上述症状，还有很明显的衰老的现象，如失眠健忘、四肢乏力、注意力不集中、性欲淡漠等。随着社会的发展，生活水平的提高，人们对自身健康和生活质量的要求越来越高，如何有效防治更年期综合征，并且能够延缓人体衰老成为医学研究的一大热点。中药复方更年安怡片的前期实验研究已经证明其具有调节植物神经功能，调节生殖内分泌，防治骨质疏松，升高去势大鼠靶细胞ER水平，上调免疫细胞ER的表达，改善免疫功能等作用。本课题将进一步探讨本方对更年期大鼠卵巢颗粒细胞凋亡及其相关的凋亡抑制基因Bcl-2和凋亡诱发基因Fas表达的影响，观察卵巢细胞的超微结构，研究该方对更年期大鼠卵巢颗粒细胞的作用，阐明其治疗更年期综合征和延缓人体衰老的机制，以期为临床运用提供新的理论和实验依据。
方法：
本实验以30只鼠龄为11～15月的自然更年期雌性SD大鼠为对象，体重250～350g，将其随机分为更年安怡片组、雌激素组、模型组，每组10只，另选用10只4～6月龄的青年大鼠作为青年组。治疗4周后，将所有大鼠颈椎脱臼法处死，取双侧卵巢，分别采用原位末端标记法(TUENL)检测卵巢颗粒细胞凋亡；免疫组化法检测颗粒细胞凋亡抑制基因Bcl-2和促进基因Fas的阳性表达结果；组织形态学检测用卵巢制成电镜超薄切片，通过透射电镜观察卵巢细胞超微结构。
结果：
1．模型组卵巢颗粒细胞凋亡阳性表达及Fas蛋白阳性表达明显高于青年组(P＜0.01)；Bcl-2蛋白阳性表达明显低于青年组(P＜0.01)；
2．经更年安怡片和雌激素治疗后，卵巢颗粒细胞凋亡阳性表达明显低于模型组(P＜0.05)；更年安怡片组和雌激素组之间比较无显著性差异(P＞0.05)；
3．更年安怡片和雌激素均能使凋亡抑制蛋白Bcl-2阳性表达较模型组显著升高(P＜0.05)；Fas蛋白阳性表达较模型组显著降低(P＜0.05)；更年安怡片组和雌激素组之间比较无显著性差异(P＞0.05)；
4．更年安怡片和雌激素都能使卵巢颗粒细胞内的线粒体、滑面内质网、胞质等有不同程度的改善。
结论：
上述结果表明：更年期大鼠卵巢颗粒细胞的凋亡阳性表达较青年期大鼠的阳性表达明显升高(P＜0.01)，其卵巢细胞内务细胞器明显衰退。更年安怡片能
更年安怡片对更年期大鼠卵巢细胞凋亡及超微结构影响的实验研究
够明显降低卵巢颗粒细胞的凋亡(P<0.05)，其治疗效果与西药雌激素比较无显
著性差异(P>0.05)。实验还表明该方能够明显改善卵巢细胞超微结构，从而
达到颗粒细胞增多，自身分泌更多雌激素的目的，体现了中医药治疗更年期综
合征及延缓衰老的作用，为临床应用更年安怡片提供新的理论依据。
Objective:
The climacteric is the transitional period of a woman from bearing age to agedness. During this period, the body has very significant physical changes. Ovaries atrophy and dysfunction gradually. The excretion of estradiol (E2) decreased markedly and the vegetative nerve dysfunction gradually occurs. As a result, the patient may have many unhappy feelings such as hot, flashes, nervousness, depression, irritability, insomnia and so on, namely the Climacteric Syndrome. With the development of the society and the enhancing of life quality, the incidence of the disease take on a trend of increasing year after year. So how to prevent and cure Climacteric Syndrome effectively becomes a pop topic of medicine study. This report made a discussion of the effects of GNAT on the apoptosis and ultrastructure of ovary granulose cells of menopausal rat. It illustrated the possible mechanism of GNAT to cure the climacteric syndrome so as to supply the clinic application the basis of theory and experiment. Method:
The study object was the female Sprague-Dawley (SD) menopausal rats of 11~15month.es old .The rats were divided randomly into 4 groups, i.e. GNAT groups, and estrogen groups, and menopausal contrast groups and with a normal groups (young rats of 4~6monthes old) as control. After 4 weeks, take the two ovaries each rat, the apoptosis expression was estimated by TUNEL, and Bcl-2 and Fas protein expression were estimated by immunohistochemical study. At the same time, we observe the ultrastructure of ovary granulose cells through electronic microscope. Result:
1.The expression of ovary granulose cells apoptosis and Fas protein of the menopausal group increased evidently (P<0. 01), at the same time Bcl-2 protein expression decreased hugely than that of the young normal group (P<0. 01);
2.After being treated with GNAT and estrogen, the expression of ovary granulose cells apoptosis decreased evidently than that of the menopausal group (P<0. 05); the differences of the above indexes between the two groups were not significant ( P>0. 05 ) ;
3.After being treated with GNAT and estrogen, the expression of Fas protein decreased while Bcl-2 protein expression increased evidently than that of the menopausal group (P<0. 05); the differences of the above indexes between the two groups were not significant ( P>0. 05 ) ;
4. GNAT and estrogen can improve the ultrastructure of ovary granulose cells. Conclusion:
The results above indicate that GNAT can decrease the apoptosis in the ovary granulose cells, but also improve the ultrastructure of ovary granulose cells. This
must be the probable action mechanism that GNAT to cure the climacteric syndrome. These evidences theoretically support the clinic application of GNAT.
更年期是人体衰老过程中生理变化非常明显的阶段，是妇女由生育期向老年期过渡的时期。此时，由于卵巢功能逐渐衰退，雌激素水平明显下降，植物神经功能紊乱，患者出现腰膝酸软、潮热汗出、心悸不宁、烦躁易怒或抑郁等症状，统称为更年期综合征。部分进入更年期的妇女不仅出现上述症状，还有很明显的衰老的现象，如失眠健忘、四肢乏力、注意力不集中、性欲淡漠等。随着社会的发展，生活水平的提高，人们对自身健康和生活质量的要求越来越高，如何有效防治更年期综合征，并且能够延缓人体衰老成为医学研究的一大热点。中药复方更年安怡片的前期实验研究已经证明其具有调节植物神经功能，调节生殖内分泌，防治骨质疏松，升高去势大鼠靶细胞ER水平，上调免疫细胞ER的表达，改善免疫功能等作用。本课题将进一步探讨本方对更年期大鼠卵巢颗粒细胞凋亡及其相关的凋亡抑制基因Bcl-2和凋亡诱发基因Fas表达的影响，观察卵巢细胞的超微结构，研究该方对更年期大鼠卵巢颗粒细胞的作用，阐明其治疗更年期综合征和延缓人体衰老的机制，以期为临床运用提供新的理论和实验依据。
方法：
本实验以30只鼠龄为11～15月的自然更年期雌性SD大鼠为对象，体重250～350g，将其随机分为更年安怡片组、雌激素组、模型组，每组10只，另选用10只4～6月龄的青年大鼠作为青年组。治疗4周后，将所有大鼠颈椎脱臼法处死，取双侧卵巢，分别采用原位末端标记法(TUENL)检测卵巢颗粒细胞凋亡；免疫组化法检测颗粒细胞凋亡抑制基因Bcl-2和促进基因Fas的阳性表达结果；组织形态学检测用卵巢制成电镜超薄切片，通过透射电镜观察卵巢细胞超微结构。
结果：
1．模型组卵巢颗粒细胞凋亡阳性表达及Fas蛋白阳性表达明显高于青年组(P＜0.01)；Bcl-2蛋白阳性表达明显低于青年组(P＜0.01)；
2．经更年安怡片和雌激素治疗后，卵巢颗粒细胞凋亡阳性表达明显低于模型组(P＜0.05)；更年安怡片组和雌激素组之间比较无显著性差异(P＞0.05)；
3．更年安怡片和雌激素均能使凋亡抑制蛋白Bcl-2阳性表达较模型组显著升高(P＜0.05)；Fas蛋白阳性表达较模型组显著降低(P＜0.05)；更年安怡片组和雌激素组之间比较无显著性差异(P＞0.05)；
4．更年安怡片和雌激素都能使卵巢颗粒细胞内的线粒体、滑面内质网、胞质等有不同程度的改善。
结论：
上述结果表明：更年期大鼠卵巢颗粒细胞的凋亡阳性表达较青年期大鼠的阳性表达明显升高(P＜0.01)，其卵巢细胞内务细胞器明显衰退。更年安怡片能
更年安怡片对更年期大鼠卵巢细胞凋亡及超微结构影响的实验研究
够明显降低卵巢颗粒细胞的凋亡(P<0.05)，其治疗效果与西药雌激素比较无显
著性差异(P>0.05)。实验还表明该方能够明显改善卵巢细胞超微结构，从而
达到颗粒细胞增多，自身分泌更多雌激素的目的，体现了中医药治疗更年期综
合征及延缓衰老的作用，为临床应用更年安怡片提供新的理论依据。
Objective:
The climacteric is the transitional period of a woman from bearing age to agedness. During this period, the body has very significant physical changes. Ovaries atrophy and dysfunction gradually. The excretion of estradiol (E2) decreased markedly and the vegetative nerve dysfunction gradually occurs. As a result, the patient may have many unhappy feelings such as hot, flashes, nervousness, depression, irritability, insomnia and so on, namely the Climacteric Syndrome. With the development of the society and the enhancing of life quality, the incidence of the disease take on a trend of increasing year after year. So how to prevent and cure Climacteric Syndrome effectively becomes a pop topic of medicine study. This report made a discussion of the effects of GNAT on the apoptosis and ultrastructure of ovary granulose cells of menopausal rat. It illustrated the possible mechanism of GNAT to cure the climacteric syndrome so as to supply the clinic application the basis of theory and experiment. Method:
The study object was the female Sprague-Dawley (SD) menopausal rats of 11~15month.es old .The rats were divided randomly into 4 groups, i.e. GNAT groups, and estrogen groups, and menopausal contrast groups and with a normal groups (young rats of 4~6monthes old) as control. After 4 weeks, take the two ovaries each rat, the apoptosis expression was estimated by TUNEL, and Bcl-2 and Fas protein expression were estimated by immunohistochemical study. At the same time, we observe the ultrastructure of ovary granulose cells through electronic microscope. Result:
1.The expression of ovary granulose cells apoptosis and Fas protein of the menopausal group increased evidently (P<0. 01), at the same time Bcl-2 protein expression decreased hugely than that of the young normal group (P<0. 01);
2.After being treated with GNAT and estrogen, the expression of ovary granulose cells apoptosis decreased evidently than that of the menopausal group (P<0. 05); the differences of the above indexes between the two groups were not significant ( P>0. 05 ) ;
3.After being treated with GNAT and estrogen, the expression of Fas protein decreased while Bcl-2 protein expression increased evidently than that of the menopausal group (P<0. 05); the differences of the above indexes between the two groups were not significant ( P>0. 05 ) ;
4. GNAT and estrogen can improve the ultrastructure of ovary granulose cells. Conclusion:
The results above indicate that GNAT can decrease the apoptosis in the ovary granulose cells, but also improve the ultrastructure of ovary granulose cells. This
must be the probable action mechanism that GNAT to cure the climacteric syndrome. These evidences theoretically support the clinic application of GNAT.
引文
[1] 熊舜华，程化奇，殷新尤，等．更年平调液对更年期大鼠作用的实验研究．湖北医科大学学报，1994，15(1)：72～75．
[2] 张家庆，邹大进．更年期综合征患者白细胞雌激素受体的变化及六味地黄丸的疗效．中西医结合杂志，1991，11(9)：521～524．
[3] 廖柏松，胡燕，鞠躬．二仙汤对18月龄雌性大鼠下丘脑-垂体-卵巢轴功能的调节．山东中医学院学报，1996，20(6)：396～398．
[4] 范红霞，万力生，黎烈荣．更年安治片治疗更年期综合征的临床与实验研究．中医药研究，1999，15(4)：45～47．
[5] 张新民，沈自尹，王文键，等．补肾中药对大鼠生殖内分泌作用机理的研究．中医杂志，1995，36(11)：686～689．
[6] 步世忠，孙梅，张沉，等．更年健上调老年雌性大鼠下丘脑雌激素受体mRNA表达对P物质和β-内啡肽的影响．中国中西医结合杂志，1998，18(1)：30～31．
[7] 王大增，朱燕清，李燕萍，等．更年舒治疗妇女更年期综合征的临床及实验研究．中国中西医结合杂志，1994，14(7)：396～398．
[8] 毋英杰，刘建璇，宋丽晶．更年欣胶囊治疗更年期综合征的实验研究．中成药，1999，21(2)：82～84．
[9] 谌兵来，唐发清，易红，等．复方更年安泰颗粒剂治疗更年期综合征的临床研究．湖南中医学院学报，1999，19(3)：35～37．
[10] 吕肖峰．中药更年舒治疗更年期综合征的临床观察和实验研究．北京中医，1995，14(2)：13～15．
[11] 廖柏松，胡燕，鞠躬，等．二仙汤对18月龄雌性大鼠下丘脑EOP含量及其mRNA水平作用的实验研究．山东中医学院学报，1996，20(6)：399～402．
[12] 江仙远，夏报信，熊舜华，等．更年平调液对女性更年期综合征患者血浆地茶酚胺的影响．新中医，1995，13(1)：63～65．
[13] 步世忠，孙梅，张沅，等．“更年健”对老年雌性大鼠中缝背核5-羟色胺的影响．解剖学杂志，1996，19(4)：309～312．
[14] 黎烈荣，谭异伦，谭宫屏．更年安信片药理作用研究．中药药理与临床，1996，12(1)：256～258．
[15] 李大金，李超荆，俞瑾，等．中药复方对更年期综合征妇女生殖内分泌-免疫功能的调节．上海免疫学杂志，1995，15(5)：257～259．
[16] 王文君，俞瑾，李大金，等，中药复方“更年健”对雌性大鼠老化过程中脾细胞雌激素受体的影响．生殖与避孕，1996，16(4)：263～265．
[17] 鲁遂荣，方学韫，侯安继，等．更年平调液对更年期大鼠自由基影响的实验研究．中国中医基础医学杂志，1998，4(8)：35～38．
[18] 顾文聪，赵伟康，韩志芬．阴虚火旺更年期综合征患者血浆过氧化脂质及性激素的变化．中医杂志，1990，15(9)：45～47．
[19] 乐杰主编．妇产科学．第五版．北京：人民卫生出版社，2001．382．
[20] 曹泽毅主编．中华妇产科学．下册．第一版．北京：人民卫生出版社，2000，2272．
[21] 袁耀萼，盛丹箐主编．妇产科新理论与新技术．上海科学技术出版社，1996，12：349．
[22]全国围绝经期妇女健康调查协作组．中华医学杂，1991，71(10)：585～587．
[23]王岩，李振彬等．中医药治疗妇女更年期综合征的现状与对策．河北中医，2001，23(4)：318～320．
[24]范红霞，万力生．补肾法对更年期综合征网络机制的影响．湖南中医药导报，1999，5(8)：32．
[25]徐叔云，卞如濂，陈修．药理实验方法学．北京：人民卫生出版，1994，1293．
[26]李玉柱，刘凤俊，单存密，等．“更年期”动物模型试制．佳木斯医学院学报，1991，14(3)：198．
[27]曲景俊，吕文珍，崔淑香，等．谷维素注射液对X线致大白鼠更年期综合征模型的治疗作用观察．中国药理学会通讯，1998，15(2)：13．
[28]程化奇，熊舜华，殷新龙，等．大鼠更年期实验模型研究．上海实验动物科学，1993，13(4)：192．
[29]梅全喜，毕焕新主编．现代中药药理手册．北京：中国中医药出版社，1998：536、581、569．
[30]梅家俊，陈振发编著．超微病理学基础与临床病理学进展．湖北中医学院出版社，2001：15～38．
[33]裴开颜，吴尔若，连瑞红等．卵泡发育和闭锁过程中肾素-血管紧张素系统与甾体激素的作用．生殖医学杂志，2001，10(3)：148～152．
[34]黄小卉，张昌军，张端莲，等．卵巢颗粒细胞凋亡率的比较．数理医药学杂志，2002，15(2)：138～139．
[35]Tsujimoto Y, Finger LR, Yunis J, et al.Cloning of the chromosome breakpoint of neoplatic B cells with the 14;18 chromosome translocation. Science, 1994,226:1097.
[36]Brunner T, Mogil RJ, Laface D, at al. Cell-autonomous Fas(CD95)/Fas-Legend intraction medicates activation-induced apoptosis in T-cell hybridomas. Nature, 1995,373:441～444.
[37]张文康主编．中西医结合医学．第一版．北京：中国中医药出版社，2000：444．
[38]王淑珍主编．妇产科理论与实践．第二版．上海：上海科学技术出版社，1991：243．
[39]庄广论．卵巢功能局部调节的研究现状及展望．中华妇产科杂志，1997，32(10)：579～581．
[40]马润玫．卵巢早衰．国外医学妇产科分册，1997，24(2)：72．
[41]邓君碧．卵巢除后的内分泌变化．实用妇产科杂志，1992，8(5)：260．
[42]俞葛锋主编．妇产科内分泌学．上册．第一版．上海：上海科学技术出版社，1983：193．
[43]张以文．绝经后妇女雌激素替代疗法的利弊与临床决策．中华妇产科杂志，1997，32(9)：515～516．
[2] 张家庆，邹大进．更年期综合征患者白细胞雌激素受体的变化及六味地黄丸的疗效．中西医结合杂志，1991，11(9)：521～524．
[3] 廖柏松，胡燕，鞠躬．二仙汤对18月龄雌性大鼠下丘脑-垂体-卵巢轴功能的调节．山东中医学院学报，1996，20(6)：396～398．
[4] 范红霞，万力生，黎烈荣．更年安治片治疗更年期综合征的临床与实验研究．中医药研究，1999，15(4)：45～47．
[5] 张新民，沈自尹，王文键，等．补肾中药对大鼠生殖内分泌作用机理的研究．中医杂志，1995，36(11)：686～689．
[6] 步世忠，孙梅，张沉，等．更年健上调老年雌性大鼠下丘脑雌激素受体mRNA表达对P物质和β-内啡肽的影响．中国中西医结合杂志，1998，18(1)：30～31．
[7] 王大增，朱燕清，李燕萍，等．更年舒治疗妇女更年期综合征的临床及实验研究．中国中西医结合杂志，1994，14(7)：396～398．
[8] 毋英杰，刘建璇，宋丽晶．更年欣胶囊治疗更年期综合征的实验研究．中成药，1999，21(2)：82～84．
[9] 谌兵来，唐发清，易红，等．复方更年安泰颗粒剂治疗更年期综合征的临床研究．湖南中医学院学报，1999，19(3)：35～37．
[10] 吕肖峰．中药更年舒治疗更年期综合征的临床观察和实验研究．北京中医，1995，14(2)：13～15．
[11] 廖柏松，胡燕，鞠躬，等．二仙汤对18月龄雌性大鼠下丘脑EOP含量及其mRNA水平作用的实验研究．山东中医学院学报，1996，20(6)：399～402．
[12] 江仙远，夏报信，熊舜华，等．更年平调液对女性更年期综合征患者血浆地茶酚胺的影响．新中医，1995，13(1)：63～65．
[13] 步世忠，孙梅，张沅，等．“更年健”对老年雌性大鼠中缝背核5-羟色胺的影响．解剖学杂志，1996，19(4)：309～312．
[14] 黎烈荣，谭异伦，谭宫屏．更年安信片药理作用研究．中药药理与临床，1996，12(1)：256～258．
[15] 李大金，李超荆，俞瑾，等．中药复方对更年期综合征妇女生殖内分泌-免疫功能的调节．上海免疫学杂志，1995，15(5)：257～259．
[16] 王文君，俞瑾，李大金，等，中药复方“更年健”对雌性大鼠老化过程中脾细胞雌激素受体的影响．生殖与避孕，1996，16(4)：263～265．
[17] 鲁遂荣，方学韫，侯安继，等．更年平调液对更年期大鼠自由基影响的实验研究．中国中医基础医学杂志，1998，4(8)：35～38．
[18] 顾文聪，赵伟康，韩志芬．阴虚火旺更年期综合征患者血浆过氧化脂质及性激素的变化．中医杂志，1990，15(9)：45～47．
[19] 乐杰主编．妇产科学．第五版．北京：人民卫生出版社，2001．382．
[20] 曹泽毅主编．中华妇产科学．下册．第一版．北京：人民卫生出版社，2000，2272．
[21] 袁耀萼，盛丹箐主编．妇产科新理论与新技术．上海科学技术出版社，1996，12：349．
[22]全国围绝经期妇女健康调查协作组．中华医学杂，1991，71(10)：585～587．
[23]王岩，李振彬等．中医药治疗妇女更年期综合征的现状与对策．河北中医，2001，23(4)：318～320．
[24]范红霞，万力生．补肾法对更年期综合征网络机制的影响．湖南中医药导报，1999，5(8)：32．
[25]徐叔云，卞如濂，陈修．药理实验方法学．北京：人民卫生出版，1994，1293．
[26]李玉柱，刘凤俊，单存密，等．“更年期”动物模型试制．佳木斯医学院学报，1991，14(3)：198．
[27]曲景俊，吕文珍，崔淑香，等．谷维素注射液对X线致大白鼠更年期综合征模型的治疗作用观察．中国药理学会通讯，1998，15(2)：13．
[28]程化奇，熊舜华，殷新龙，等．大鼠更年期实验模型研究．上海实验动物科学，1993，13(4)：192．
[29]梅全喜，毕焕新主编．现代中药药理手册．北京：中国中医药出版社，1998：536、581、569．
[30]梅家俊，陈振发编著．超微病理学基础与临床病理学进展．湖北中医学院出版社，2001：15～38．
[33]裴开颜，吴尔若，连瑞红等．卵泡发育和闭锁过程中肾素-血管紧张素系统与甾体激素的作用．生殖医学杂志，2001，10(3)：148～152．
[34]黄小卉，张昌军，张端莲，等．卵巢颗粒细胞凋亡率的比较．数理医药学杂志，2002，15(2)：138～139．
[35]Tsujimoto Y, Finger LR, Yunis J, et al.Cloning of the chromosome breakpoint of neoplatic B cells with the 14;18 chromosome translocation. Science, 1994,226:1097.
[36]Brunner T, Mogil RJ, Laface D, at al. Cell-autonomous Fas(CD95)/Fas-Legend intraction medicates activation-induced apoptosis in T-cell hybridomas. Nature, 1995,373:441～444.
[37]张文康主编．中西医结合医学．第一版．北京：中国中医药出版社，2000：444．
[38]王淑珍主编．妇产科理论与实践．第二版．上海：上海科学技术出版社，1991：243．
[39]庄广论．卵巢功能局部调节的研究现状及展望．中华妇产科杂志，1997，32(10)：579～581．
[40]马润玫．卵巢早衰．国外医学妇产科分册，1997，24(2)：72．
[41]邓君碧．卵巢除后的内分泌变化．实用妇产科杂志，1992，8(5)：260．
[42]俞葛锋主编．妇产科内分泌学．上册．第一版．上海：上海科学技术出版社，1983：193．
[43]张以文．绝经后妇女雌激素替代疗法的利弊与临床决策．中华妇产科杂志，1997，32(9)：515～516．