板栗组织培养及褐变研究
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摘要
本实验以板栗品种韶十八为主要材料，其余十个品种作为辅助研究材料，通过组织培养技术，利用不同品种、不同外植体部位的板栗，研究板栗愈伤组织诱导、继代培养和植株再生的适宜培养基。结果表明，不同的品种适宜培养基不同，韶十八的适宜培养基为WPM+6-BA_(0.5)+NAA_(0.2)，以其胚培养诱导率较高，成愈率为79.5％。
由于板栗单宁含量很高，故在板栗组织培养过程(无论是初代培养还是继代培养)中，外植体都易发生褐变，导致培养物生理功能衰退，严重阻碍了板栗组织培养的正常进行。本文以韶十八愈伤组织为材料，对板栗外植体褐变相关的生理因子及影响因素进行了系统研究，目的在于了解减轻板栗褐变的有效措施，从理论上认识外植体组织褐变；通过研究各因素对褐变的影响，找到影响褐变的主导因子，以及减轻褐变的有效方法，以期为板栗褐变提供理论依据和技术支持。本试验通过研究不同浓度不同种类的抗褐变剂、不同浓度的AgNO_3、不同光照条件、不同温度、不同pH值对愈伤组织褐变的影响，研究了各个因素对褐变程度的影响，结果表明：在6g.L~(-1)PVP、10mg.L~(-1)AgNO_3、前期暗处理、19℃、pH值为5.8～6.0条件下培养，有利于减轻褐变。另外，对不同品种不同材料的过氧化物同工酶谱进行研究，可以看出不同品种之间的亲缘关系，以及不同材料的分化程度。
本文对褐变的机理进行初步研究，分别统计和测定培养期间褐变率、PPO活性、POD活性，研究培养过程中酶的活性变化与外植体褐变的关系，结果表明：板栗组织培养过程中，PPO活性与褐变存在显著的相关关系，PPO活性高的处理其褐变率也较高，POD活性与褐变之间无相关性。试验研究不同伤害程度与愈伤组织总酚含量之间的关系，发现褐变不仅是因为原有的酚类与PPO反应，而且由于伤害作用产生了新的酚类化合物，从而加剧了褐变。
Castanea mollissima species shao shiba was the main research material in this experiment, other ten species were assistance research material. I researched the optimum medium of the different species and explant for inducing callus, subculture and regenerate on Castanea mollissima through tissue culture technique. The results showed that different species of Castanea mollissima need different medium, and WPM + 6-BA0.5+NAA0.2 was shao shiba's optimum inducing medium, and the inducement rate of embryo (79.5%) was higher than other explants. The subculture medium of shao shiba was WPM+6-BA0.5-1.0+NAA0.2.
Because of containing much tannin, the explant of Castanea mollissima brown seriously, which interfered with normal propagation of Castanea mollissima tissue culture. Take shao shiba as research material, I studied the mechanism of explant browning of Castanea mollissima and factors influencing the explant browning in subculture. Then 1 find out the efficiency measures of alleviating browning.
I researched the effect on browning of different concentration added materials , different concentration of AgNO3, light condition, temperature and pH. The result suggested that the conditions of 6g. L-1 PVP, 10mg.L-1 AgNO3, prophase dark treatment, 19℃ and pH 5.8 - 6.0 avail to lighten brownimg. Electrophoretic character of POD isozyme of the different species' different materials were studied, 1 found out the relation of different species and the differentiation degree of different materials.
According to the browning phenomenon of Castanea mollissima in plant tissue culture and the activity of the peroxidase and polyphenolic oxidase, the results of my study indicated that the activity of PPO has relativity with the browning of the callus, that is the higher activity of enzyme,the more severity of browning.But POD was not as PPO.At the same time, analyzing correlation reveals that the correlation relationship of different harm degree and total phenol content is significant, 1 conclude that harm produce more phenolic, so total phenolic content deteriorate the degree of browning.
由于板栗单宁含量很高，故在板栗组织培养过程(无论是初代培养还是继代培养)中，外植体都易发生褐变，导致培养物生理功能衰退，严重阻碍了板栗组织培养的正常进行。本文以韶十八愈伤组织为材料，对板栗外植体褐变相关的生理因子及影响因素进行了系统研究，目的在于了解减轻板栗褐变的有效措施，从理论上认识外植体组织褐变；通过研究各因素对褐变的影响，找到影响褐变的主导因子，以及减轻褐变的有效方法，以期为板栗褐变提供理论依据和技术支持。本试验通过研究不同浓度不同种类的抗褐变剂、不同浓度的AgNO_3、不同光照条件、不同温度、不同pH值对愈伤组织褐变的影响，研究了各个因素对褐变程度的影响，结果表明：在6g.L~(-1)PVP、10mg.L~(-1)AgNO_3、前期暗处理、19℃、pH值为5.8～6.0条件下培养，有利于减轻褐变。另外，对不同品种不同材料的过氧化物同工酶谱进行研究，可以看出不同品种之间的亲缘关系，以及不同材料的分化程度。
本文对褐变的机理进行初步研究，分别统计和测定培养期间褐变率、PPO活性、POD活性，研究培养过程中酶的活性变化与外植体褐变的关系，结果表明：板栗组织培养过程中，PPO活性与褐变存在显著的相关关系，PPO活性高的处理其褐变率也较高，POD活性与褐变之间无相关性。试验研究不同伤害程度与愈伤组织总酚含量之间的关系，发现褐变不仅是因为原有的酚类与PPO反应，而且由于伤害作用产生了新的酚类化合物，从而加剧了褐变。
Castanea mollissima species shao shiba was the main research material in this experiment, other ten species were assistance research material. I researched the optimum medium of the different species and explant for inducing callus, subculture and regenerate on Castanea mollissima through tissue culture technique. The results showed that different species of Castanea mollissima need different medium, and WPM + 6-BA0.5+NAA0.2 was shao shiba's optimum inducing medium, and the inducement rate of embryo (79.5%) was higher than other explants. The subculture medium of shao shiba was WPM+6-BA0.5-1.0+NAA0.2.
Because of containing much tannin, the explant of Castanea mollissima brown seriously, which interfered with normal propagation of Castanea mollissima tissue culture. Take shao shiba as research material, I studied the mechanism of explant browning of Castanea mollissima and factors influencing the explant browning in subculture. Then 1 find out the efficiency measures of alleviating browning.
I researched the effect on browning of different concentration added materials , different concentration of AgNO3, light condition, temperature and pH. The result suggested that the conditions of 6g. L-1 PVP, 10mg.L-1 AgNO3, prophase dark treatment, 19℃ and pH 5.8 - 6.0 avail to lighten brownimg. Electrophoretic character of POD isozyme of the different species' different materials were studied, 1 found out the relation of different species and the differentiation degree of different materials.
According to the browning phenomenon of Castanea mollissima in plant tissue culture and the activity of the peroxidase and polyphenolic oxidase, the results of my study indicated that the activity of PPO has relativity with the browning of the callus, that is the higher activity of enzyme,the more severity of browning.But POD was not as PPO.At the same time, analyzing correlation reveals that the correlation relationship of different harm degree and total phenol content is significant, 1 conclude that harm produce more phenolic, so total phenolic content deteriorate the degree of browning.
引文
[1]潘瑞炽，董愚得．植物生理学[M]．北京：高等教育出版社，1995：249～251．
[2]曹孜义，刘国民．实用植物绵织培养技术教程[M]．兰州：甘肃科学技术出版社，1996：1～8．
[3]Haberlandt G. Kulturversuche Mit Isolierten Pflanzenzellen[J].Sitzungsber Math-Naturwiss Klasse Kais Akad Wiss Wien. 1902,111:69～92.
[4]Skoog F, Miller CO..Chemical Regulation Of Growth Organ Formation In Plant Tissue Cultivated In Vitro [A].In:Biological Action Of Growth Subatances 11th[C]. Symp. Soc. Epx. Biol.,1957,11:118～131.
[5]Steward F.C.,Mapes M.O.,Mears K..Growth And Organized Development Of Cultured Cells. Ⅱ Organization In Cultures Grown From Freely Suspended Cells[J]. American Journal Of Botany ,1958,45:705～708.
[6]Reonert J. Uber Die Controller Der Morphogenes And Die Induction Von Adventive-Embryonen An Gewebekulturen Aus Karotten[J]. Plant, 1959, 53:318～333.
[7]Takebe T. Regulation Of Whole Plants From Isolated Mesophyll Protoplasts Of Tobacco[J].Nature, 1971,58:318～320.
[8]Raemakers C.J.J.M.,Jacobsen E.,Visser R.G.F..Secondaty Somatic Embryogenesis And Applications In Plant Breeding [J].Euphytica, 1995,81:93～107.
[9]Avihai P.,Ofra P.L.,Abu-Abied M.,Holland O..Establishment Of An Agrobacterium-Nediated Transformation System For Grape:The Role Of Antioxidants During Grape-Agrobacterium Interations[J].Nature Biotechnology, 1996,14:625～628.
[10]matinelli l.,mandoline g..genetic transformation and regeneration of transgenic planting rapevine (vitis rupestris s)[J]. theor. appl. genet.,1994,88:621～628.
[11]张松，李纪蓉，李滨，等．分葱组织培养体细胞胚胎发生的研究[J]．园艺学报，1997，24(3)：264～268．
[12]伍宁丰，范云六．苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白基因等杨树工程植株等建立[J]．科学通讯，1991，(9)：705～708．
[13]徐子勤，贾敬芬．豆科植物的体细胞杂交[J]．植物生理学通讯，1997，33(4)：288～291．
[14]许智宏．植物生理学和生物工程[J]．植物生理学通，1994，30(3)：228～240．
[15]陈如珠．柑桔三倍体曲的试管嫁接及微繁殖研究[J]．中国柑桔，1992，21(4)：10～12．
[16]刘淑琼，母锡金．马铃薯离体胚乳的研究[J]．植物学报，1981，23(1)：72～74．
[17]屈云慧，吴丽芳，杨春梅．百合幼胚离体培养成株体系的建立[J]．云南农业科技，2002(2)：9～12．
[18]黄济明．百合的组织培养和试管内诱发多倍体试验[J]．园艺学报，1983，10(2)：125～128．
[19]马国斌，王鸣，郑学勤．甜瓜组织培养再生植株中的四倍体变异[J]．园艺学报，1999，26(2)：128～130．
[20]李海燕，张丽娟，田和平．细胞和组织培养技术在植物育种中的应用[J]．天津农林科技，1999(5)．
[21]R．H．Smith等著，王晓燕译．植物组织培养进行高粱改良[J]．国外农学—杂粮作物，1999，19(3)：15～18．
[22]秦明波，云月．植物生物技术讲座(六)—植物组织培养技术与遗传育种[J]．生物学通
报，1994，29(5)：32～33．
[23]赵晓明，李明山，宋秀英．通过组织培养筛选番茄抗甲疫病突变体[J]．山西农业大学学报，1996，16(4)：350～353．
[24]张举仁，高树芳，杨爱芳，等．利用组织培养技术选育玉米抗小叶斑病突变体[J]．生物工程学报，1998(10)：456～459．
[25]阮义理．植物细胞培养技术在抗病育种上的应用[J]．世界农业，1986，1：28～30．
[26]郑康乐．水稻体细胞无性系变异利抗性细胞突变体筛选的研究进展[J]．国外农学——水稻，1985，2：11～14．
[27]Larkin, P. J. ,W. R. Scowcroft, Somaclonal variation anovel source of variability from cell cultures for plant improvement. Theor. Appl. Genet.,1981, 60:197～214.
[28]张立钦，郑勇平，罗士元，等．杨树湿地松组织培养愈伤组织耐盐性[J]．浙江林学院学报，1997．14(1)：16～21．
[29]翟凤林，曹鸣庆．植物的耐盐性及其改良[M]．北京：农业出版社，1989．149～237．
[30]张立钦等．杨树组织培养愈伤组织对水泡型溃疡病的抗性[J]．南京林业大学学报，1989，13(4)：9～15．
[31]李光斌等．用离体培养技术筛选茄子抗盐突变体研究[J]．科技通报，1990，6(5)：271～275．
[32]周荣仁等．利用组织培养研究植物耐盐机理与筛选耐盐突变体的进展[J]．植物生理学通讯，1989，25(5)：11～19．
[33]Ostry M.E. Application Of Biotechnology For The Development Of Disease-Resistant Popular. In:Ed. Lin D, Hubbes M. Zsuffa L. Proceedings IEA/BA Task Ⅱ Workshop Biotechnology Development[M].Toronto:University Of Toronto, 1988,88:13～28.
[34]谢耀坚．桉树组织培养研究进展[J]．世界林业研究，2000，13(6)：14～19．
[35]罗士韦，许智宏．经济植物组织培养[M]．北京：科学出版社，1988：108～111．
[36]杨乃博．几种木本植物组织培养及器官发生[J]．植物生理学通讯，1982，18(2)：23～27．
[37]索长江，蔡斌华．樟树丛生芽的诱导和加速繁殖研究[J]．林业科技开发，1997，(3)：29～30．
[38]程广有，唐晓杰．东北红豆杉茎尖组织培养[J]．吉林林学院学报，1997，13(4)：201～211．
[39]黄健秋，际志明，许智宏．云南松成熟胚的体细胞胚胎发生研究[J]．实验生物学报，1995，28：371～379．
[40]罗建勋．南洋杉组织培养与快速繁殖研究[J]．园艺学报，1997，24(1)：100～102．
[41]张玉芹，宋加录．提高板栗嫁接成活率的技术措施[J]．中国林副特产，2002，(2)：14．
[42]彭信海，宾秋实．植物组织培养林木遗传育种中的应用[J]．经济林研究，1998，16(2)：54～55．
[43]徐启江，陈典．茎尖分生组织培养在植物病毒防治中的应用[J]．生物学教学，2001，26(9)：4～5．
[44]范志强，冯敬奎，张繁亮，等．热处理茎尖培养法快速繁育苹果无毒苗木[J]．山东林业科技，1997增刊：5～8．
[45]陈海彬．板栗疫病的发生与防治[J]．安徽林业，2000(1)：30．
[46]王新花，万光生，孟宪鹏，等．不同板栗品种对栗疫菌的抗性研究[J]．落叶果树，1998(1)：17～20．
[47]程继鸿，秦岭，高遐红．板粟抗粟疫病的研究进展[J]．北京农学院学报，1997，12(2)：77～82．
[48]王军．美洲栗抗疫病基因工程研究简介[J]．森林病虫通讯，2000(5)：45～46．
[49]赵军良，高等植物组织培养与种质保存[J]．生物学杂志，1995(3)：32～33．
[50]黄霞，黄学林，高东微．防止香蕉茎尖培养中外植体褐变的研究[J]．广西植物，1999，19(1)：78～80．
[51]孙震晓，马清温．抗癌植物药及其植物组织培养研究进展[J]．生物学通报，2000．35(8)：11～12．
[52]张青叶，丛月珠．新的一类抗肿瘤药物-紫杉醇与Tax-otere[J]．中草药，1995，26(12)：657．
[53]邱德有等．东北红豆杉细胞克隆技术的研究[J]．中国中药杂志，1998，23(5)：265．
[54]陈永勤，吴蕴祺，胡秋，等．苯丙氨酸、蔗糖、甘露醇对杂种红豆杉细胞的生长及形成紫杉醇、巴卡亭和10-去乙酰基巴卡亭的影响[J]．药学学报，1998，33(2)：132～137．
[55]张以恒，钟建江，俞俊棠．三七悬浮细胞高密度培养生产人参皂甙和多糖[J]．华东理工大学学报，1997，23(3)：310～314．
[56]王雅茜，石轶松，阚建全．植物细胞和组织培养技术在食品添加剂生产上的应用及前景[J]．食品工业科技1999，20(3)：66～67．
[57]Heike Do rnenburg and Dietrick Knorr. Challenges and Opportunites for Metabolite Production from Plant Cell and Tissue Cultures. Food Technology, 51 (11): 47～54.
[58]Funk. C. and Brodelius, PE. Phenylpropanoid metabolism in suspension cultures of Vanilla planifolia Andr, 11. Effects of precursor feeding and metabolic inhihitors. Plant Physiol, 94:95～101.
[59]Do rnenburg, H. and Knorr. D. Production of phenolic flavor compounds with cultured cells and tissues of Vanilla Species. Food Biotechnol, 10(1):75～92.
[60]Do Rnenburg, H. And Knorr, D. Generation Of Colors And Flavors In Plantcell And Tissue Cultures. Crit, Rer. Plant Sci, 15(2):141～168.
[61]Nancy A. Higley and JohnB. Hallagan. Safety and Regulatation of Ingredients Produced by Plant cell and Tissue Culture. Food Technology, 51(11): 72～74.
[62]Darrhua Yu, Carole Pmeredith. The Influence Of Explant Origin On Tissue Browning And Shoot Production In Shoottip Cultures Of Grapecine, Jamer Soc Hort Sci, 1986,456～466.
[63]loomis wdbattaile j. plant phenolic compounds and the isolation of plant enzymes, phytochem, 1966, 5: 423～438.
[64]Hollings M, Stone OM. Techniques and problems in the production oF virus-tested plant material. Sci Hort, 1968, 20: 57～72.
[65]鞠志国，朱广廉，曹宗巽．莱阳茌梨果实褐变与PPO及酚类物质区域化分布的关系．植物生理学报，1988，14(4)：256～261．
[66]鞠志国．PPO及其底物对梨组织褐变的影响．莱阳农学院学报，1987，4(2)：42～47．
[67]鞠志国．酚类物质与梨果实品质的研究进展．莱阳农学院学报，1988，5(3)：59～65．
[68]Zaid A. in vitro browning of tissues and media with special emphasis to dte palm cultures—a review, acta hort 1987, 212: 561～566.
[69]战淑敏，王然，曲善洲，等．莱阳茌梨成龄树茎尖培养的研究．莱阳农学院学报，1992，9(2)：108～112．
[70]李焕秀，晏本菊．梨外植体组培褐变与氧化酶活性和同工酶的关系．西南农业大学学
报，2001，23(5)：432～434．
[71]罗晓芳，田砚亭，姚洪军．组织培养过程中PPO活性和总酚含量的研究．北京林业大学学报，1999，21(1)：92～95．
[72]董建华．几种热带水果的褐变与PPO．热带作物研究，1990(2)：92～99．
[73]谭兴杰，李月标．荔枝果皮PPO的部分纯化及性质．植物生理学报，1984，10(4)：339～345．
[74]谭兴杰，李月标．荔枝果皮PPO酶促褐变的研究．植物生理学报，1987，13(2)：197～203．
[75]王泽农主编．茶叶生物化学[M]，北京：农业出版社，1980．2．
[76]林植芳，林桂珠，孙谷畴．人为调节荔枝果皮有机自由基及其与果皮褐变的可能关系．试验生物学报，1994，27(4)：383～387．
[77]徐寿昌．有机化学(第2版)．北京：高等教育出版社，1993．234～235．
[78]宋平，沈丙辉．活性炭培养基对棉花愈伤组织诱导的效果．植物生理学通讯，1988(5)：47～48．
[79]丁双阳，胡小松．马铃薯丝加工中的褐变因素及其控制．辽宁农业科学，1992(6)：33～36．
[80]霍均生，佟代言，刘彩莉，等．鸭梨黑心褐变过程中过氧化及细胞内膜微粘度的变化，园艺学报，1995(3)：221～224．
[81]林值芳等．水稻叶片衰老与超氧化物歧化酶及膜脂过氧化作用的关系．植物学报，1984，26：605．
[82]Hu CY, Wang Pj. Meristem, shoot tip and bud cultures. In: Emvans DA, Sharp WR, Ammirato PV et al(eds).Handbook of Plant Cell Culture(Volum Ⅰ).New York: Macmillan Publishing Co.A Division of Macmillan, Inc.,1983,177～228.
[83]Faust M. Physiology of Temperate Zone Fuit Trees. New York: Wiley-Interscience, 1989, 110～114.
[84]韩碧文，刘淑兰．核桃组织培养．见：陈正华主编．木本植物组织培养及其应用[M]．北京：高等教育出版社，1986，456～465．
[85]Chevre AM. In vitro vegetative multiplication of chestnut. J Hortsci, 1983,58(1): 23～29.
[86]平吉成．苹果属几个种的组织培养繁殖技术及其组培苗缺铁胁迫反应的研究[D]．北京：北京农业大学，1994．
[87]Yu DH, Meredith CPJ. The influence of explant origin on tissue browning and shoot tip culture of grapevine. J Amer Soc Hort Sci, 1986,111(6):972～975.
[88]王法照，牟文中，杜鹏，等．苹果脱毒苗工厂化繁殖技术研究[J]．烟台果树，1994，4：18～21．
[89]Hollings M, Stone OM. Techniques and problems in the production of virus-tested plant material. Sci. Hort, 1968, 20:57～72.
[90]Stone OM. Factors affecting the growth of camation plants from shoot apices. Ann Applied Boil, 1963, 52: 199～209.
[91]崔元方，龚峥，油棕的组织培养[A]．见陈正华主编，木本植物组织培养及其应用[C]．高教出版社，1986，466～480．
[92]邱璐，陈善娜，杨跃仙，等．云桑组织培养中褐化问题的研究[J]．蚕业科学，2000，26(2)：118～119，
[93]吴国栗，陈国秀．苹果及其砧木茎尖研究进展[J]．北方园艺，1992，5：23～28．
[94]王续衍，林秦碧．苹果组织培养研究简报[J]．四川农业大学学报，1988，3(1)：46～48．
[95]Wang QC, Tang HR, Quan Y et al. Phenol Induced browning and establishment of shoot-tip explants of 'Fuji' apple and 'jinhua pear' cultured in vitro. J Hort Sci, 1994,69(5): 833-839.
[96]蒋迪军，牛建新．苹果茎尖快速繁殖研究．新疆农业科学，1992，4：171～173．
[97]Reuveni O, Kipnis HL. Studies of the in vitro culture of date palm (Phoenix dactylitera L.)tissues and organs. Pamphlet, 1974,145:20.
[98]晏本菊，李焕秀．梨外植体褐变与多酚氧化酶及酚类物质关系．四川农业大学学报，1998，16(3)：310～313．
[99]裘文达，曹孜义．植物组织培养实用技术．北京：高等教育出版社，1989，96～98．
[100]Zaid A. In vitro browning of tissues and media with special, emphasis to date palm cultures____A review. Acta Hort, 1987, 212:561～566.
[101]杨海霞，朱祥瑞．桑叶片培养中影响因子的研究概况．蚕桑通报，2000，33(2)：5～8．
[102]苏勇．板栗加工褐变现象的研究[J]．中南林学院学报，1998，18(1)：74～79．
[103]Hildebrandt V, Harney PM. Factors affecting the release of phenolic exudates from explants of pelargonium hortorum Bailey 'Sprinter Scarlet'. J Hort Sci, 1988,63(4):651～657.
[104]Hu CY, Wang PJ. Handbook of plant cell culture, macmillan, 1983(1):177～227.
[105]Andrew J, Schmidt, James M Lee. Media and enciornmental effects on phonolics production from tobacco cell cultures. Biltechem and Bioengineering, 1989, 33: 1437～1444.
[106]王平，邢伟一，孙吉康．生物化学实验技术．中南林学院出版，1999．
[107]Creasey LL, The increase in pehenyalanine ammonialyase activity in strawberry leaf disks and its correlation with flavonoid synthesis. Phytochem, 1968,7:441～446.
[108]陈正华．木本植物组纵培养一般技术．木本植物组织培养及其应用[M]．高等教育出版社，1986 24～74．
[109]韩素英，齐立旺，张淑改，等．核桃组培中防止组织氧化褐变措施的研究[J]．山西农业大学学报，1995，15(4)：339～341．
[110]刘用生，李友勇．植物组织培养中活性炭的作用．植物生理学通讯，1994，30(3)：214～217．
[111]姚洪军，罗晓芳，田砚亭．植物组织培养外植体褐变的研究进展[J]．北京林业大学学报，1999，21(3)：78～84．
[112]佟屏亚．果树史话[M]．农业出版社，1983．
[113]高新一，板栗栽培技术[M]．金盾出版社，1992．
[114]张宇和，王福堂等．板栗[M]．中国林业出版社，1989．
[115]冯学文．实用果树栽培技术[M]．天津科学技术出版社，1993．
[116]张宁和，王福堂等，板栗[M]．中国林业出版社，1989．
[117]王陵诗．名优板栗 核桃 枣高产栽培技术[M]．中国人事出版社，1996．
[118]板栗分产林标准化协作组，我国板栗产区的划分及分产栽培技术要点[J]．经济林研究，1989，(1)．
[119]陈在新，魏天才．板栗的营养保健作用及其开发利用[J]．农牧产品开发，1999，(4)：4～5．
[120]齐敏，岳崇峰，李玉梅．板栗的药用价值及开发[J]．中国林副特产，1997，42(3)：51～52．
[121]施必青，王学勤，颜务林，等．我国板栗研究文献分析[J]．浙江林业科技，2000，(5)：67～71．
[122]王志杰．板栗的繁殖和建园技术研究[J]．河北林学院学报，1996，(10)：127～130．
[123]杨镇．板粟嫩枝扦插研究初报[J]．广西林业科技，1990，(3)．
[124]Vieitez F．板栗的营养繁殖[M]．郑止善译。林业科技资料统译，1978，(4)．
[125]胡婉仪等．板栗嫩枝扦插繁殖的研究[J]．华中农业大学学报，1990，(1)．
[126]许智宏．植物生理学和生物工程[J]．植物生理学通讯，1994，30(3)：228～240．
[127]王新花，潘若良，王会永，等．板栗疫病的侵染循环规律[J]．山东林业科技，1998，(1)：21～23．
[128]张俊波，毋亚梅，陈云怒．板栗的几种主要害虫防治方法[J]．云南农业科技，2002，(2)：36～37．
[129]倪乐湘，童新旺，潭瑞成，等．湖南板栗害虫及防治途径[J]．湖南林业科技，1997，24(3)：17～24．
[130]范志强，冯敬奎，张繁亮，等．热处理茎尖培养法快速繁育苹果无毒苗木[J]．山东林业科技，1997增刊：5～8．
[131]盛长忠，王淑芳，王宁宁，等．红豆杉愈伤组织培养中褐变现象的初探．南开大学学报，2001，34(4)：120～122．
[132]赵晓明，李明山，宋秀英．通过组织培养筛选番茄抗早疫病突变体[J]．山西农业大学学报，1996，16(4)：350～353．
[133]张利群．板栗产业的发展趋势与对策思考[J]．贵州林业科技，1999，(2)：61～63．
[134]Kwys, —RN. ect. 1987; Requirements for the uniform growth of callus cultures of four species of castanea, West—Virginia-forestry notes. 13:P19-24.
[135]Shreve, —LW, 1974; Propagation of Walnut, Chestnutand Pecan by rooted cuttings Proceedngs of the central states Forest tree improvernent Conference, 20～23.
[136]McPheeters, K, ect. 1980: Culture of chestnut (castanea spp) in vitro, hortscience, 15:3 Ⅱ 417～418.
[137]Hunter—AG, ect. 1985; Rooting stem cutting of chestnut scientia-Horticulturae. 26: 1. 43～45.
[138]Vieites AM, Vieites ML. Culturel of chestnut shoots from buds in vitro, j hort sci, 1980, 55: 83～84.
[139]蒋丽娟，李昌珠．栗树生物技术研究现状及应用前景[J]．湖南林业科技，1996，23(4)：51～53．
[140]Yang—QG, ect·1986; Effect of cytoklnln, IBA and rooting regime on chinese chestmut culture in Vitro, Hortscence: 21: 1. 133～134.
[141]李焕秀，王乔春，李春秀．梨芽和茎尖多酚氧化酶活性和总酚含量的初步研究[J]．四川农业大学学报，1994，2(2)：218～222．
[142]张志良．植物生理学实验指导．高等教育出版社，1990．
[143]梁一池，杨华．植物组织培养技术的研究进展[J]．福建林学院学报，2002，22(1)：1～3．
[144]鲁旭东．植物组织培养中褐变的发生与防止．农业与技术，1999，19(4)：9．
[145]赵玉军．防止组织培养外植体接种后褐化的方法[J]．山西果树，1995，(2)．
[2]曹孜义，刘国民．实用植物绵织培养技术教程[M]．兰州：甘肃科学技术出版社，1996：1～8．
[3]Haberlandt G. Kulturversuche Mit Isolierten Pflanzenzellen[J].Sitzungsber Math-Naturwiss Klasse Kais Akad Wiss Wien. 1902,111:69～92.
[4]Skoog F, Miller CO..Chemical Regulation Of Growth Organ Formation In Plant Tissue Cultivated In Vitro [A].In:Biological Action Of Growth Subatances 11th[C]. Symp. Soc. Epx. Biol.,1957,11:118～131.
[5]Steward F.C.,Mapes M.O.,Mears K..Growth And Organized Development Of Cultured Cells. Ⅱ Organization In Cultures Grown From Freely Suspended Cells[J]. American Journal Of Botany ,1958,45:705～708.
[6]Reonert J. Uber Die Controller Der Morphogenes And Die Induction Von Adventive-Embryonen An Gewebekulturen Aus Karotten[J]. Plant, 1959, 53:318～333.
[7]Takebe T. Regulation Of Whole Plants From Isolated Mesophyll Protoplasts Of Tobacco[J].Nature, 1971,58:318～320.
[8]Raemakers C.J.J.M.,Jacobsen E.,Visser R.G.F..Secondaty Somatic Embryogenesis And Applications In Plant Breeding [J].Euphytica, 1995,81:93～107.
[9]Avihai P.,Ofra P.L.,Abu-Abied M.,Holland O..Establishment Of An Agrobacterium-Nediated Transformation System For Grape:The Role Of Antioxidants During Grape-Agrobacterium Interations[J].Nature Biotechnology, 1996,14:625～628.
[10]matinelli l.,mandoline g..genetic transformation and regeneration of transgenic planting rapevine (vitis rupestris s)[J]. theor. appl. genet.,1994,88:621～628.
[11]张松，李纪蓉，李滨，等．分葱组织培养体细胞胚胎发生的研究[J]．园艺学报，1997，24(3)：264～268．
[12]伍宁丰，范云六．苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白基因等杨树工程植株等建立[J]．科学通讯，1991，(9)：705～708．
[13]徐子勤，贾敬芬．豆科植物的体细胞杂交[J]．植物生理学通讯，1997，33(4)：288～291．
[14]许智宏．植物生理学和生物工程[J]．植物生理学通，1994，30(3)：228～240．
[15]陈如珠．柑桔三倍体曲的试管嫁接及微繁殖研究[J]．中国柑桔，1992，21(4)：10～12．
[16]刘淑琼，母锡金．马铃薯离体胚乳的研究[J]．植物学报，1981，23(1)：72～74．
[17]屈云慧，吴丽芳，杨春梅．百合幼胚离体培养成株体系的建立[J]．云南农业科技，2002(2)：9～12．
[18]黄济明．百合的组织培养和试管内诱发多倍体试验[J]．园艺学报，1983，10(2)：125～128．
[19]马国斌，王鸣，郑学勤．甜瓜组织培养再生植株中的四倍体变异[J]．园艺学报，1999，26(2)：128～130．
[20]李海燕，张丽娟，田和平．细胞和组织培养技术在植物育种中的应用[J]．天津农林科技，1999(5)．
[21]R．H．Smith等著，王晓燕译．植物组织培养进行高粱改良[J]．国外农学—杂粮作物，1999，19(3)：15～18．
[22]秦明波，云月．植物生物技术讲座(六)—植物组织培养技术与遗传育种[J]．生物学通
报，1994，29(5)：32～33．
[23]赵晓明，李明山，宋秀英．通过组织培养筛选番茄抗甲疫病突变体[J]．山西农业大学学报，1996，16(4)：350～353．
[24]张举仁，高树芳，杨爱芳，等．利用组织培养技术选育玉米抗小叶斑病突变体[J]．生物工程学报，1998(10)：456～459．
[25]阮义理．植物细胞培养技术在抗病育种上的应用[J]．世界农业，1986，1：28～30．
[26]郑康乐．水稻体细胞无性系变异利抗性细胞突变体筛选的研究进展[J]．国外农学——水稻，1985，2：11～14．
[27]Larkin, P. J. ,W. R. Scowcroft, Somaclonal variation anovel source of variability from cell cultures for plant improvement. Theor. Appl. Genet.,1981, 60:197～214.
[28]张立钦，郑勇平，罗士元，等．杨树湿地松组织培养愈伤组织耐盐性[J]．浙江林学院学报，1997．14(1)：16～21．
[29]翟凤林，曹鸣庆．植物的耐盐性及其改良[M]．北京：农业出版社，1989．149～237．
[30]张立钦等．杨树组织培养愈伤组织对水泡型溃疡病的抗性[J]．南京林业大学学报，1989，13(4)：9～15．
[31]李光斌等．用离体培养技术筛选茄子抗盐突变体研究[J]．科技通报，1990，6(5)：271～275．
[32]周荣仁等．利用组织培养研究植物耐盐机理与筛选耐盐突变体的进展[J]．植物生理学通讯，1989，25(5)：11～19．
[33]Ostry M.E. Application Of Biotechnology For The Development Of Disease-Resistant Popular. In:Ed. Lin D, Hubbes M. Zsuffa L. Proceedings IEA/BA Task Ⅱ Workshop Biotechnology Development[M].Toronto:University Of Toronto, 1988,88:13～28.
[34]谢耀坚．桉树组织培养研究进展[J]．世界林业研究，2000，13(6)：14～19．
[35]罗士韦，许智宏．经济植物组织培养[M]．北京：科学出版社，1988：108～111．
[36]杨乃博．几种木本植物组织培养及器官发生[J]．植物生理学通讯，1982，18(2)：23～27．
[37]索长江，蔡斌华．樟树丛生芽的诱导和加速繁殖研究[J]．林业科技开发，1997，(3)：29～30．
[38]程广有，唐晓杰．东北红豆杉茎尖组织培养[J]．吉林林学院学报，1997，13(4)：201～211．
[39]黄健秋，际志明，许智宏．云南松成熟胚的体细胞胚胎发生研究[J]．实验生物学报，1995，28：371～379．
[40]罗建勋．南洋杉组织培养与快速繁殖研究[J]．园艺学报，1997，24(1)：100～102．
[41]张玉芹，宋加录．提高板栗嫁接成活率的技术措施[J]．中国林副特产，2002，(2)：14．
[42]彭信海，宾秋实．植物组织培养林木遗传育种中的应用[J]．经济林研究，1998，16(2)：54～55．
[43]徐启江，陈典．茎尖分生组织培养在植物病毒防治中的应用[J]．生物学教学，2001，26(9)：4～5．
[44]范志强，冯敬奎，张繁亮，等．热处理茎尖培养法快速繁育苹果无毒苗木[J]．山东林业科技，1997增刊：5～8．
[45]陈海彬．板栗疫病的发生与防治[J]．安徽林业，2000(1)：30．
[46]王新花，万光生，孟宪鹏，等．不同板栗品种对栗疫菌的抗性研究[J]．落叶果树，1998(1)：17～20．
[47]程继鸿，秦岭，高遐红．板粟抗粟疫病的研究进展[J]．北京农学院学报，1997，12(2)：77～82．
[48]王军．美洲栗抗疫病基因工程研究简介[J]．森林病虫通讯，2000(5)：45～46．
[49]赵军良，高等植物组织培养与种质保存[J]．生物学杂志，1995(3)：32～33．
[50]黄霞，黄学林，高东微．防止香蕉茎尖培养中外植体褐变的研究[J]．广西植物，1999，19(1)：78～80．
[51]孙震晓，马清温．抗癌植物药及其植物组织培养研究进展[J]．生物学通报，2000．35(8)：11～12．
[52]张青叶，丛月珠．新的一类抗肿瘤药物-紫杉醇与Tax-otere[J]．中草药，1995，26(12)：657．
[53]邱德有等．东北红豆杉细胞克隆技术的研究[J]．中国中药杂志，1998，23(5)：265．
[54]陈永勤，吴蕴祺，胡秋，等．苯丙氨酸、蔗糖、甘露醇对杂种红豆杉细胞的生长及形成紫杉醇、巴卡亭和10-去乙酰基巴卡亭的影响[J]．药学学报，1998，33(2)：132～137．
[55]张以恒，钟建江，俞俊棠．三七悬浮细胞高密度培养生产人参皂甙和多糖[J]．华东理工大学学报，1997，23(3)：310～314．
[56]王雅茜，石轶松，阚建全．植物细胞和组织培养技术在食品添加剂生产上的应用及前景[J]．食品工业科技1999，20(3)：66～67．
[57]Heike Do rnenburg and Dietrick Knorr. Challenges and Opportunites for Metabolite Production from Plant Cell and Tissue Cultures. Food Technology, 51 (11): 47～54.
[58]Funk. C. and Brodelius, PE. Phenylpropanoid metabolism in suspension cultures of Vanilla planifolia Andr, 11. Effects of precursor feeding and metabolic inhihitors. Plant Physiol, 94:95～101.
[59]Do rnenburg, H. and Knorr. D. Production of phenolic flavor compounds with cultured cells and tissues of Vanilla Species. Food Biotechnol, 10(1):75～92.
[60]Do Rnenburg, H. And Knorr, D. Generation Of Colors And Flavors In Plantcell And Tissue Cultures. Crit, Rer. Plant Sci, 15(2):141～168.
[61]Nancy A. Higley and JohnB. Hallagan. Safety and Regulatation of Ingredients Produced by Plant cell and Tissue Culture. Food Technology, 51(11): 72～74.
[62]Darrhua Yu, Carole Pmeredith. The Influence Of Explant Origin On Tissue Browning And Shoot Production In Shoottip Cultures Of Grapecine, Jamer Soc Hort Sci, 1986,456～466.
[63]loomis wdbattaile j. plant phenolic compounds and the isolation of plant enzymes, phytochem, 1966, 5: 423～438.
[64]Hollings M, Stone OM. Techniques and problems in the production oF virus-tested plant material. Sci Hort, 1968, 20: 57～72.
[65]鞠志国，朱广廉，曹宗巽．莱阳茌梨果实褐变与PPO及酚类物质区域化分布的关系．植物生理学报，1988，14(4)：256～261．
[66]鞠志国．PPO及其底物对梨组织褐变的影响．莱阳农学院学报，1987，4(2)：42～47．
[67]鞠志国．酚类物质与梨果实品质的研究进展．莱阳农学院学报，1988，5(3)：59～65．
[68]Zaid A. in vitro browning of tissues and media with special emphasis to dte palm cultures—a review, acta hort 1987, 212: 561～566.
[69]战淑敏，王然，曲善洲，等．莱阳茌梨成龄树茎尖培养的研究．莱阳农学院学报，1992，9(2)：108～112．
[70]李焕秀，晏本菊．梨外植体组培褐变与氧化酶活性和同工酶的关系．西南农业大学学
报，2001，23(5)：432～434．
[71]罗晓芳，田砚亭，姚洪军．组织培养过程中PPO活性和总酚含量的研究．北京林业大学学报，1999，21(1)：92～95．
[72]董建华．几种热带水果的褐变与PPO．热带作物研究，1990(2)：92～99．
[73]谭兴杰，李月标．荔枝果皮PPO的部分纯化及性质．植物生理学报，1984，10(4)：339～345．
[74]谭兴杰，李月标．荔枝果皮PPO酶促褐变的研究．植物生理学报，1987，13(2)：197～203．
[75]王泽农主编．茶叶生物化学[M]，北京：农业出版社，1980．2．
[76]林植芳，林桂珠，孙谷畴．人为调节荔枝果皮有机自由基及其与果皮褐变的可能关系．试验生物学报，1994，27(4)：383～387．
[77]徐寿昌．有机化学(第2版)．北京：高等教育出版社，1993．234～235．
[78]宋平，沈丙辉．活性炭培养基对棉花愈伤组织诱导的效果．植物生理学通讯，1988(5)：47～48．
[79]丁双阳，胡小松．马铃薯丝加工中的褐变因素及其控制．辽宁农业科学，1992(6)：33～36．
[80]霍均生，佟代言，刘彩莉，等．鸭梨黑心褐变过程中过氧化及细胞内膜微粘度的变化，园艺学报，1995(3)：221～224．
[81]林值芳等．水稻叶片衰老与超氧化物歧化酶及膜脂过氧化作用的关系．植物学报，1984，26：605．
[82]Hu CY, Wang Pj. Meristem, shoot tip and bud cultures. In: Emvans DA, Sharp WR, Ammirato PV et al(eds).Handbook of Plant Cell Culture(Volum Ⅰ).New York: Macmillan Publishing Co.A Division of Macmillan, Inc.,1983,177～228.
[83]Faust M. Physiology of Temperate Zone Fuit Trees. New York: Wiley-Interscience, 1989, 110～114.
[84]韩碧文，刘淑兰．核桃组织培养．见：陈正华主编．木本植物组织培养及其应用[M]．北京：高等教育出版社，1986，456～465．
[85]Chevre AM. In vitro vegetative multiplication of chestnut. J Hortsci, 1983,58(1): 23～29.
[86]平吉成．苹果属几个种的组织培养繁殖技术及其组培苗缺铁胁迫反应的研究[D]．北京：北京农业大学，1994．
[87]Yu DH, Meredith CPJ. The influence of explant origin on tissue browning and shoot tip culture of grapevine. J Amer Soc Hort Sci, 1986,111(6):972～975.
[88]王法照，牟文中，杜鹏，等．苹果脱毒苗工厂化繁殖技术研究[J]．烟台果树，1994，4：18～21．
[89]Hollings M, Stone OM. Techniques and problems in the production of virus-tested plant material. Sci. Hort, 1968, 20:57～72.
[90]Stone OM. Factors affecting the growth of camation plants from shoot apices. Ann Applied Boil, 1963, 52: 199～209.
[91]崔元方，龚峥，油棕的组织培养[A]．见陈正华主编，木本植物组织培养及其应用[C]．高教出版社，1986，466～480．
[92]邱璐，陈善娜，杨跃仙，等．云桑组织培养中褐化问题的研究[J]．蚕业科学，2000，26(2)：118～119，
[93]吴国栗，陈国秀．苹果及其砧木茎尖研究进展[J]．北方园艺，1992，5：23～28．
[94]王续衍，林秦碧．苹果组织培养研究简报[J]．四川农业大学学报，1988，3(1)：46～48．
[95]Wang QC, Tang HR, Quan Y et al. Phenol Induced browning and establishment of shoot-tip explants of 'Fuji' apple and 'jinhua pear' cultured in vitro. J Hort Sci, 1994,69(5): 833-839.
[96]蒋迪军，牛建新．苹果茎尖快速繁殖研究．新疆农业科学，1992，4：171～173．
[97]Reuveni O, Kipnis HL. Studies of the in vitro culture of date palm (Phoenix dactylitera L.)tissues and organs. Pamphlet, 1974,145:20.
[98]晏本菊，李焕秀．梨外植体褐变与多酚氧化酶及酚类物质关系．四川农业大学学报，1998，16(3)：310～313．
[99]裘文达，曹孜义．植物组织培养实用技术．北京：高等教育出版社，1989，96～98．
[100]Zaid A. In vitro browning of tissues and media with special, emphasis to date palm cultures____A review. Acta Hort, 1987, 212:561～566.
[101]杨海霞，朱祥瑞．桑叶片培养中影响因子的研究概况．蚕桑通报，2000，33(2)：5～8．
[102]苏勇．板栗加工褐变现象的研究[J]．中南林学院学报，1998，18(1)：74～79．
[103]Hildebrandt V, Harney PM. Factors affecting the release of phenolic exudates from explants of pelargonium hortorum Bailey 'Sprinter Scarlet'. J Hort Sci, 1988,63(4):651～657.
[104]Hu CY, Wang PJ. Handbook of plant cell culture, macmillan, 1983(1):177～227.
[105]Andrew J, Schmidt, James M Lee. Media and enciornmental effects on phonolics production from tobacco cell cultures. Biltechem and Bioengineering, 1989, 33: 1437～1444.
[106]王平，邢伟一，孙吉康．生物化学实验技术．中南林学院出版，1999．
[107]Creasey LL, The increase in pehenyalanine ammonialyase activity in strawberry leaf disks and its correlation with flavonoid synthesis. Phytochem, 1968,7:441～446.
[108]陈正华．木本植物组纵培养一般技术．木本植物组织培养及其应用[M]．高等教育出版社，1986 24～74．
[109]韩素英，齐立旺，张淑改，等．核桃组培中防止组织氧化褐变措施的研究[J]．山西农业大学学报，1995，15(4)：339～341．
[110]刘用生，李友勇．植物组织培养中活性炭的作用．植物生理学通讯，1994，30(3)：214～217．
[111]姚洪军，罗晓芳，田砚亭．植物组织培养外植体褐变的研究进展[J]．北京林业大学学报，1999，21(3)：78～84．
[112]佟屏亚．果树史话[M]．农业出版社，1983．
[113]高新一，板栗栽培技术[M]．金盾出版社，1992．
[114]张宇和，王福堂等．板栗[M]．中国林业出版社，1989．
[115]冯学文．实用果树栽培技术[M]．天津科学技术出版社，1993．
[116]张宁和，王福堂等，板栗[M]．中国林业出版社，1989．
[117]王陵诗．名优板栗 核桃 枣高产栽培技术[M]．中国人事出版社，1996．
[118]板栗分产林标准化协作组，我国板栗产区的划分及分产栽培技术要点[J]．经济林研究，1989，(1)．
[119]陈在新，魏天才．板栗的营养保健作用及其开发利用[J]．农牧产品开发，1999，(4)：4～5．
[120]齐敏，岳崇峰，李玉梅．板栗的药用价值及开发[J]．中国林副特产，1997，42(3)：51～52．
[121]施必青，王学勤，颜务林，等．我国板栗研究文献分析[J]．浙江林业科技，2000，(5)：67～71．
[122]王志杰．板栗的繁殖和建园技术研究[J]．河北林学院学报，1996，(10)：127～130．
[123]杨镇．板粟嫩枝扦插研究初报[J]．广西林业科技，1990，(3)．
[124]Vieitez F．板栗的营养繁殖[M]．郑止善译。林业科技资料统译，1978，(4)．
[125]胡婉仪等．板栗嫩枝扦插繁殖的研究[J]．华中农业大学学报，1990，(1)．
[126]许智宏．植物生理学和生物工程[J]．植物生理学通讯，1994，30(3)：228～240．
[127]王新花，潘若良，王会永，等．板栗疫病的侵染循环规律[J]．山东林业科技，1998，(1)：21～23．
[128]张俊波，毋亚梅，陈云怒．板栗的几种主要害虫防治方法[J]．云南农业科技，2002，(2)：36～37．
[129]倪乐湘，童新旺，潭瑞成，等．湖南板栗害虫及防治途径[J]．湖南林业科技，1997，24(3)：17～24．
[130]范志强，冯敬奎，张繁亮，等．热处理茎尖培养法快速繁育苹果无毒苗木[J]．山东林业科技，1997增刊：5～8．
[131]盛长忠，王淑芳，王宁宁，等．红豆杉愈伤组织培养中褐变现象的初探．南开大学学报，2001，34(4)：120～122．
[132]赵晓明，李明山，宋秀英．通过组织培养筛选番茄抗早疫病突变体[J]．山西农业大学学报，1996，16(4)：350～353．
[133]张利群．板栗产业的发展趋势与对策思考[J]．贵州林业科技，1999，(2)：61～63．
[134]Kwys, —RN. ect. 1987; Requirements for the uniform growth of callus cultures of four species of castanea, West—Virginia-forestry notes. 13:P19-24.
[135]Shreve, —LW, 1974; Propagation of Walnut, Chestnutand Pecan by rooted cuttings Proceedngs of the central states Forest tree improvernent Conference, 20～23.
[136]McPheeters, K, ect. 1980: Culture of chestnut (castanea spp) in vitro, hortscience, 15:3 Ⅱ 417～418.
[137]Hunter—AG, ect. 1985; Rooting stem cutting of chestnut scientia-Horticulturae. 26: 1. 43～45.
[138]Vieites AM, Vieites ML. Culturel of chestnut shoots from buds in vitro, j hort sci, 1980, 55: 83～84.
[139]蒋丽娟，李昌珠．栗树生物技术研究现状及应用前景[J]．湖南林业科技，1996，23(4)：51～53．
[140]Yang—QG, ect·1986; Effect of cytoklnln, IBA and rooting regime on chinese chestmut culture in Vitro, Hortscence: 21: 1. 133～134.
[141]李焕秀，王乔春，李春秀．梨芽和茎尖多酚氧化酶活性和总酚含量的初步研究[J]．四川农业大学学报，1994，2(2)：218～222．
[142]张志良．植物生理学实验指导．高等教育出版社，1990．
[143]梁一池，杨华．植物组织培养技术的研究进展[J]．福建林学院学报，2002，22(1)：1～3．
[144]鲁旭东．植物组织培养中褐变的发生与防止．农业与技术，1999，19(4)：9．
[145]赵玉军．防止组织培养外植体接种后褐化的方法[J]．山西果树，1995，(2)．