阳春砂组织培养与辐射诱变育种的初步研究
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摘要
砂仁是我国著名的“四大南药”之一,收载于《中国药典》(2005年版一部),来源为姜科植物阳春砂Amomum villosum Lour.、绿壳砂Amomum villosum Lour.var. xanthioides T.L.Wu et Senjen或海南砂Amomumlongiligulare T.L.Wu的干燥成熟果实。具化湿开胃、温脾止泻、理气安胎等功效。从我国目前对砂仁药材质量的研究、药源、商品调查的结果看,砂仁药材的三种植物来源以阳春砂的品质最好。然而阳春砂生长对生态环境有特殊的选择和要求,且自花授粉困难,产量较低。
1目的
本课题对阳春砂进行组织培养、再生体系的建立及辐射诱变育种的研究,一方面通过阳春砂植物组织培养建立起从外植体到不定芽,再到完整植株的再生体系,并在此基础上进行辐射处理,初步摸索适合的辐射剂量,以及进行变异株系的初步筛选。另一方面,直接用种子和根茎芽为辐射诱变材料,在摸索适合辐射剂量的基础上进行辐射诱变处理、播种,筛选有益变异株系,为获得阳春砂高产优质新品种打下基础。本研究工作旨在利用植物组织培养技术和辐射诱变技术对阳春砂进行诱变,筛选高产优质的阳春砂变异品种。
2方法
2.1阳春砂三个栽培品种种子研究
从种子形态、色泽、气味、千粒重、含水量、成熟度、饱满度、生活力等方面对阳春砂三个栽培品种种子的常规参数特性和种子实际发芽特性进行测定和比较,更全面地认识阳春砂种子的特性,有利于选出更适合进一步培育和研究的品种,且为下一步新品种的选育打下基础。
2.2阳春砂种子最适发芽条件研究
以阳春砂种子为材料,比较光照条件、不同发芽床(基质)、不同培养温度对种子萌发的影响,并用不同浓度赤霉素(GA3)处理,研究外源激素对阳春砂种子萌发的影响,确定加快阳春砂种子萌发和提高其发芽率的有效途径。
2.3阳春砂植物组织培养
以阳春砂种子为起始材料,培养获得无菌苗。以其茎基部为外植体,接种到加有不同浓度的激素培养基上诱导不定芽,再生成完整植株,建立起阳春砂直接器官分化途径的快速再生体系。
2.4阳春砂辐射育种研究
分别以阳春砂种子、根茎芽、组培不定芽为材料,进行不同剂量的60Co-γ射线辐射诱变,将辐射材料培养成苗,统计和记录其存活率、植株形态数据等,确定种子、根茎芽、组培不定芽等材料的合适辐射剂量范围；并以合适剂量进行大批量辐射诱变处理,寻找有益变异株系。
2.5 ISSR分子标记分析辐射材料的遗传差异
提取辐射后存活植株叶片中的DNA,进行ISSR分子标记分析,对尚无表观变异的育种材料在DNA水平上进行筛选。
3结果
3.1阳春砂三个栽培品种种子研究
通过对09年阳春砂三个栽培品种种子的横纵径、厚度、种子常规参数进行测定,长果和圆果在各方面差别不大,仅在种子纵径和生活力上有显著差异；而春选在种子纵径方面与长果有极显著性差异,在千粒重、含水量、饱满度、成熟度、生活力各方面与长果和圆果种子存在着显著性或极显著性差异。而在后面的三个品种发芽实验中春选也比较特别,它的发芽较长果、圆果晚,故发芽势较低,而在后期却又大量萌发,发芽率较高。综合以上研究,确定以长果种子为材料进行下一步的发芽实验。
3.2阳春砂种子最适发芽条件研究
阳春砂种子的萌发需要光照；种子在湿润滤纸上发芽率和发芽势明显优于MS培养基；25℃-30℃培养有利于种子的萌发；400 mg·L-1的GA3引发有利于促进阳春砂种子的萌发,缩短发芽时间。
3.3阳春砂植物组织培养
以无菌苗的茎基部为外植体接种到加有不同浓度6-BA和NAA的MS培养基上,在培养约4 d后开始出芽,约30 d后分化出1-4个不定芽,供试的9种培养基诱导的不定芽均能再生植株。在几种激素浓度配比中,以添加4.0 mg·L-1 6-BA和0.1 mg·L-1NAA的培养基的不定芽诱导率和出芽倍数最高。
3.4辐射育种研究
根据辐射诱变后种子发芽实验和根茎芽培养育苗实验结果,确定了种子合适的辐射剂量范围是13-15 Gy,根茎芽的合适剂量范围为15-30 Gy。对已获得的苗龄1年以上的根茎芽辐射诱变存活株系"0708CG1”、“0704YG1”和种子诱变获得的实生苗“0809CG1”-“0809CG6”,与对照进行了植株形态上的比较,没有发现显著性差异,以上辐照植株均未进入花期,未能进行花果形态的观察比较。组培不定芽在16 Gy辐射剂量处理后长出的叶片有部分致变现象,且出现明显的矮化,而确定最适的辐射剂量还需经过进一步的观察。
3.5 ISSR分子标记分析辐射材料的遗传差异
采用9条ISSR引物对部分阳春砂辐射株系及对照株系进行PCR扩增,扩增条带的分子量范围在250～5000 bp之间。但9条引物对阳春砂辐射株系及对照株系扩增出来的片段数均相同,无多态性片段。辐射株系与对照株系可能在基因组DNA上没有差异。
4结论
成功确定了适合阳春砂种子萌发的最适发芽条件,并建立起快速获得大量阳春砂无菌苗的组织培养再生体系,二者结合为下一步的辐射诱变育种打下坚实的基础。经60Co辐射诱变处理,已获得一批辐射存活株系。加之ISSR分子标记技术的应用,能有效缩小阳春砂育种群体,加快育种速度,提高育种效率。
Villous amomum fruit, one of the valuble Chinese herbs in South China, is a useful medicine included in the 2010's Pharmacopoeis of People's Repoblic of China, and it origin from family Zingiberaceae, Amomum villosum Lour., Amomum villosum Lour.var,xanthioides T.L.Wu et Senjen and Amomumlongiligulare T.L.Wu,In Tradicional Chinese Medicine(TCM), it is used for dissipating dampness and appetizing, warming spleen and stopping diarrhea, regulating Qi flow and preventing miscarriage. Among the three kinds of herbs resources, Amomum villosum Lour.is the best. The growth of AV needs special ecological environment and it is hard to be pollinated by itself, which leading to a low yield.
1 Objective
Studying on tissue culture, plantlet regeneration, and radiation breeding of Amomum villosum, the ideal regeneration system of Amomum villosum. was established and using adventitious buds,which got from tissue culture, for mutation breeding by radiation to explore the radiation dose and selecte the useful radiation lines. For another hand, using seeds and buds for mutation breeding by radiation to explore the radiation dose and selecte the useful the radiation lines. The purpose of this study is to find a useful mutants of Amomum villosum.
2 Methods
2.1 research on three kinds of cultivars of Amomum villosum seeds
To explore the differences of the shapes of seeds and germination characters of three kinds of cultivars. Characters of the seeds'appearance were observed. The morphology, color and luster, scent, one thousand-seed weight, moisture content, ripeness, plumpness, viability, germination percentage and germination vigor etc. were measured.
2.2 study on Amomum villosum seed germination
The seeds of Amomum villosum were treated with different illumination condition, germination bed and temperature to find a optimum germination condition and using GA3 with different concentration to accelerate germination.
2.3 study on Amomum villosum in vitro and it's rapid propagation
After seeds of Amomum villosum germinating in sterile conditions, taking the basal internode of seedlings as explants, adventitious buds multiplication of Amomum villosum were studied. It was fund a way to establish a regeneration system.
2.4 studies on radiation breeding of Amomum villosum
The seeds, rhizomatic buds, cultured buds of Amomum villosum were radiated by 60Co-γray to discuss the optimum irradiation dose. The different irradiation doses had some effect on the seedling growth of Amomum villosum, and to find the survival mutants.
2.5 identification of the mutants by inter-simple sequence repeat (ISSR) markers
Analysis of the survival mutants was done with DNA extraction; polymerase chain reaction (PCR) amplification using 9 polymorphism primers.The ISSR molecular marker technique was applied to analyze the genome DNA diversity of radiation treated plants, which expressed no difference with control by characters of the lines'appearance.
3 Results
3.1 research on three kinds of cultivars of Amomum villosum seeds
The longitudinal diameter, transverse diameter, thickness, seed characteristics, germination of the three kinds of cultivars of Amomum villosum seeds were measured. The kind of ChangGuo and YuanGuo just has little difference but ChunXuan has significant difference in longitudinal diameter, one thousand-seed weight, moisture content, ripeness, plumpness, viability. Study on seed germination experiment, ChunXuan is especial, which has low germination potential and high germination rate. Above all, the kind of ChangGuo was selected for the next germination study.
3.2 study on Amomum villosum seed germination
The results showed that light is necessary for Amomum villosum seeds germination.The germination rate and germination potential of the seeds on moist filter paper are both higher than that on the MS medium.The optimal temperature for the seeds germination is 25-30℃. GA3(400 mg·L-1) priming accelerates seeds germination significantly and enhances germination potential.
3.3 study on Amomum villosum in vitro and it's rapid propagation
Taking the basal internode of seedlings as explants, the best initiation multiplication medium was MS+6-BA 4.0 mg·L-1+NAA0.1 mg·L-1. Shoot sprouting was initiated after 4 days, and it got 1-4 shoots after 30 d later. Besides, in the medium of MS for plant regeneration was apt.
3.4 studies on radiation breeding of Amomum villosum
The result showed that the optimum irradiation dose for seeds' radiation is 13-15 Gy and for rhizomatic buds is 15-30 Gy. Presently there were 1 line, marked" 0704YG1" which grew up from seeds treated by 60Co-y ray and 7 lines, marked"0708CG1、0809CG1～0809CG6"which grew up from rhizomatic buds treated by 60Co-γray. But they didn't have significant morphological characters. Cultured buds treated with 16 Gy by 60Co-y ray has some character variations.The optimum irradiation dose for cultured buds' radiation need next explore.
3.5 identification of the survival mutants by inter-simple sequence repeat markers
Using 9 primers in PCR and sepharose electrophoresis. The DNA fragments were obtained and their sizes were from 250～5000 bp through ISSR amplification, but has no polymorphic bands.
4 Conclusion
The optimum germination condition for seeds of Amomum villosum germinating is found. The method to make Amomum villosum in vitro and rapid propagating is found. Basis in them, the seeds, rhizomatic buds, cultured buds were radiated by 60Co-y ray to discuss the optimum irradiation dose and obtained some survival lines. In addition, ISSR was applicated to identification the survival mutants. All those make it possible to obtain several new lines which have higher yield and better qualities through multi-generation screening from the offspring of irradiated Amomum villosum.
1目的
本课题对阳春砂进行组织培养、再生体系的建立及辐射诱变育种的研究,一方面通过阳春砂植物组织培养建立起从外植体到不定芽,再到完整植株的再生体系,并在此基础上进行辐射处理,初步摸索适合的辐射剂量,以及进行变异株系的初步筛选。另一方面,直接用种子和根茎芽为辐射诱变材料,在摸索适合辐射剂量的基础上进行辐射诱变处理、播种,筛选有益变异株系,为获得阳春砂高产优质新品种打下基础。本研究工作旨在利用植物组织培养技术和辐射诱变技术对阳春砂进行诱变,筛选高产优质的阳春砂变异品种。
2方法
2.1阳春砂三个栽培品种种子研究
从种子形态、色泽、气味、千粒重、含水量、成熟度、饱满度、生活力等方面对阳春砂三个栽培品种种子的常规参数特性和种子实际发芽特性进行测定和比较,更全面地认识阳春砂种子的特性,有利于选出更适合进一步培育和研究的品种,且为下一步新品种的选育打下基础。
2.2阳春砂种子最适发芽条件研究
以阳春砂种子为材料,比较光照条件、不同发芽床(基质)、不同培养温度对种子萌发的影响,并用不同浓度赤霉素(GA3)处理,研究外源激素对阳春砂种子萌发的影响,确定加快阳春砂种子萌发和提高其发芽率的有效途径。
2.3阳春砂植物组织培养
以阳春砂种子为起始材料,培养获得无菌苗。以其茎基部为外植体,接种到加有不同浓度的激素培养基上诱导不定芽,再生成完整植株,建立起阳春砂直接器官分化途径的快速再生体系。
2.4阳春砂辐射育种研究
分别以阳春砂种子、根茎芽、组培不定芽为材料,进行不同剂量的60Co-γ射线辐射诱变,将辐射材料培养成苗,统计和记录其存活率、植株形态数据等,确定种子、根茎芽、组培不定芽等材料的合适辐射剂量范围；并以合适剂量进行大批量辐射诱变处理,寻找有益变异株系。
2.5 ISSR分子标记分析辐射材料的遗传差异
提取辐射后存活植株叶片中的DNA,进行ISSR分子标记分析,对尚无表观变异的育种材料在DNA水平上进行筛选。
3结果
3.1阳春砂三个栽培品种种子研究
通过对09年阳春砂三个栽培品种种子的横纵径、厚度、种子常规参数进行测定,长果和圆果在各方面差别不大,仅在种子纵径和生活力上有显著差异；而春选在种子纵径方面与长果有极显著性差异,在千粒重、含水量、饱满度、成熟度、生活力各方面与长果和圆果种子存在着显著性或极显著性差异。而在后面的三个品种发芽实验中春选也比较特别,它的发芽较长果、圆果晚,故发芽势较低,而在后期却又大量萌发,发芽率较高。综合以上研究,确定以长果种子为材料进行下一步的发芽实验。
3.2阳春砂种子最适发芽条件研究
阳春砂种子的萌发需要光照；种子在湿润滤纸上发芽率和发芽势明显优于MS培养基；25℃-30℃培养有利于种子的萌发；400 mg·L-1的GA3引发有利于促进阳春砂种子的萌发,缩短发芽时间。
3.3阳春砂植物组织培养
以无菌苗的茎基部为外植体接种到加有不同浓度6-BA和NAA的MS培养基上,在培养约4 d后开始出芽,约30 d后分化出1-4个不定芽,供试的9种培养基诱导的不定芽均能再生植株。在几种激素浓度配比中,以添加4.0 mg·L-1 6-BA和0.1 mg·L-1NAA的培养基的不定芽诱导率和出芽倍数最高。
3.4辐射育种研究
根据辐射诱变后种子发芽实验和根茎芽培养育苗实验结果,确定了种子合适的辐射剂量范围是13-15 Gy,根茎芽的合适剂量范围为15-30 Gy。对已获得的苗龄1年以上的根茎芽辐射诱变存活株系"0708CG1”、“0704YG1”和种子诱变获得的实生苗“0809CG1”-“0809CG6”,与对照进行了植株形态上的比较,没有发现显著性差异,以上辐照植株均未进入花期,未能进行花果形态的观察比较。组培不定芽在16 Gy辐射剂量处理后长出的叶片有部分致变现象,且出现明显的矮化,而确定最适的辐射剂量还需经过进一步的观察。
3.5 ISSR分子标记分析辐射材料的遗传差异
采用9条ISSR引物对部分阳春砂辐射株系及对照株系进行PCR扩增,扩增条带的分子量范围在250～5000 bp之间。但9条引物对阳春砂辐射株系及对照株系扩增出来的片段数均相同,无多态性片段。辐射株系与对照株系可能在基因组DNA上没有差异。
4结论
成功确定了适合阳春砂种子萌发的最适发芽条件,并建立起快速获得大量阳春砂无菌苗的组织培养再生体系,二者结合为下一步的辐射诱变育种打下坚实的基础。经60Co辐射诱变处理,已获得一批辐射存活株系。加之ISSR分子标记技术的应用,能有效缩小阳春砂育种群体,加快育种速度,提高育种效率。
Villous amomum fruit, one of the valuble Chinese herbs in South China, is a useful medicine included in the 2010's Pharmacopoeis of People's Repoblic of China, and it origin from family Zingiberaceae, Amomum villosum Lour., Amomum villosum Lour.var,xanthioides T.L.Wu et Senjen and Amomumlongiligulare T.L.Wu,In Tradicional Chinese Medicine(TCM), it is used for dissipating dampness and appetizing, warming spleen and stopping diarrhea, regulating Qi flow and preventing miscarriage. Among the three kinds of herbs resources, Amomum villosum Lour.is the best. The growth of AV needs special ecological environment and it is hard to be pollinated by itself, which leading to a low yield.
1 Objective
Studying on tissue culture, plantlet regeneration, and radiation breeding of Amomum villosum, the ideal regeneration system of Amomum villosum. was established and using adventitious buds,which got from tissue culture, for mutation breeding by radiation to explore the radiation dose and selecte the useful radiation lines. For another hand, using seeds and buds for mutation breeding by radiation to explore the radiation dose and selecte the useful the radiation lines. The purpose of this study is to find a useful mutants of Amomum villosum.
2 Methods
2.1 research on three kinds of cultivars of Amomum villosum seeds
To explore the differences of the shapes of seeds and germination characters of three kinds of cultivars. Characters of the seeds'appearance were observed. The morphology, color and luster, scent, one thousand-seed weight, moisture content, ripeness, plumpness, viability, germination percentage and germination vigor etc. were measured.
2.2 study on Amomum villosum seed germination
The seeds of Amomum villosum were treated with different illumination condition, germination bed and temperature to find a optimum germination condition and using GA3 with different concentration to accelerate germination.
2.3 study on Amomum villosum in vitro and it's rapid propagation
After seeds of Amomum villosum germinating in sterile conditions, taking the basal internode of seedlings as explants, adventitious buds multiplication of Amomum villosum were studied. It was fund a way to establish a regeneration system.
2.4 studies on radiation breeding of Amomum villosum
The seeds, rhizomatic buds, cultured buds of Amomum villosum were radiated by 60Co-γray to discuss the optimum irradiation dose. The different irradiation doses had some effect on the seedling growth of Amomum villosum, and to find the survival mutants.
2.5 identification of the mutants by inter-simple sequence repeat (ISSR) markers
Analysis of the survival mutants was done with DNA extraction; polymerase chain reaction (PCR) amplification using 9 polymorphism primers.The ISSR molecular marker technique was applied to analyze the genome DNA diversity of radiation treated plants, which expressed no difference with control by characters of the lines'appearance.
3 Results
3.1 research on three kinds of cultivars of Amomum villosum seeds
The longitudinal diameter, transverse diameter, thickness, seed characteristics, germination of the three kinds of cultivars of Amomum villosum seeds were measured. The kind of ChangGuo and YuanGuo just has little difference but ChunXuan has significant difference in longitudinal diameter, one thousand-seed weight, moisture content, ripeness, plumpness, viability. Study on seed germination experiment, ChunXuan is especial, which has low germination potential and high germination rate. Above all, the kind of ChangGuo was selected for the next germination study.
3.2 study on Amomum villosum seed germination
The results showed that light is necessary for Amomum villosum seeds germination.The germination rate and germination potential of the seeds on moist filter paper are both higher than that on the MS medium.The optimal temperature for the seeds germination is 25-30℃. GA3(400 mg·L-1) priming accelerates seeds germination significantly and enhances germination potential.
3.3 study on Amomum villosum in vitro and it's rapid propagation
Taking the basal internode of seedlings as explants, the best initiation multiplication medium was MS+6-BA 4.0 mg·L-1+NAA0.1 mg·L-1. Shoot sprouting was initiated after 4 days, and it got 1-4 shoots after 30 d later. Besides, in the medium of MS for plant regeneration was apt.
3.4 studies on radiation breeding of Amomum villosum
The result showed that the optimum irradiation dose for seeds' radiation is 13-15 Gy and for rhizomatic buds is 15-30 Gy. Presently there were 1 line, marked" 0704YG1" which grew up from seeds treated by 60Co-y ray and 7 lines, marked"0708CG1、0809CG1～0809CG6"which grew up from rhizomatic buds treated by 60Co-γray. But they didn't have significant morphological characters. Cultured buds treated with 16 Gy by 60Co-y ray has some character variations.The optimum irradiation dose for cultured buds' radiation need next explore.
3.5 identification of the survival mutants by inter-simple sequence repeat markers
Using 9 primers in PCR and sepharose electrophoresis. The DNA fragments were obtained and their sizes were from 250～5000 bp through ISSR amplification, but has no polymorphic bands.
4 Conclusion
The optimum germination condition for seeds of Amomum villosum germinating is found. The method to make Amomum villosum in vitro and rapid propagating is found. Basis in them, the seeds, rhizomatic buds, cultured buds were radiated by 60Co-y ray to discuss the optimum irradiation dose and obtained some survival lines. In addition, ISSR was applicated to identification the survival mutants. All those make it possible to obtain several new lines which have higher yield and better qualities through multi-generation screening from the offspring of irradiated Amomum villosum.
引文
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