豆磺隆酶联免疫分析方法的研究
摘要
本论文针对目前磺酰脲类除草剂豆磺隆残留分析问题，采用农药免疫分析技术建立了以豆磺隆中间体为原料和琥珀酸酐在DBU催化下合成了豆磺隆的半抗原，通过活化脂法获得了突出豆磺隆特异性分子结构的免疫抗原和包被抗原，分别以BSA和OVA为载体蛋白。以BSA为免疫抗原免疫家兔获得高效价的多克隆抗体，用间接ELISA法对抗体的工作条件，抗体的特异性、方法的精确性、重复性进行研究。试验结论如下：
1人工抗原的合成及鉴定
利用豆磺隆的特异性磺酰胺部位与琥珀酸酐反应制备半抗原，经熔点试验为167—169℃。利用活化脂法将BSA与半抗原连接制备免疫抗原；将OVA、HSA与半抗原连接制备包被抗原。通过紫外扫描；电泳法和琼脂双扩散法三种方法来鉴定连接方法，在免疫前可以通过紫外扫描和电泳方法来鉴定，在免疫后获得抗体利用琼脂双扩散进行鉴别抗原决定簇。
2豆磺隆ELISA试验条件
利用间接ELISA法测定抗血清与半抗原-OVA，半抗原-BSA，半抗原-HAS结合的中点效价为2×10~4，1×10~4，1×10~4与OVA无结合活性。在间接ELISA法测定中用0.05mol/L，pH9.6碳酸盐缓冲液将包被抗原(半抗原-OVA)稀释4000倍(v/v)包被酶标板，包被时间3小时(37℃)。抗血清稀释4000倍应用，竞争时间20分钟(37℃)。酶标第二抗体浓度是稀释1000倍。反应时间为30分钟。以邻苯二胺为底物，用2M硫酸液终止。竞争时间缩短后本底变浅当20分钟时效果最好本底与竞争30分钟降低0.15-0.2。
3豆磺隆ELISA法分析标准曲线及特异性
在优化条件下豆磺隆ELISA标准曲线检测的线性范围是0.2—200ng/ml。回归方程为y=-0.3543x+1.2929检测限为0.7ng/ml，相关系数r~2=0.999。抑制率曲线方程是y=-0.0757x+0.2274r~2=0.9933 Ic50为36.6ng/ml。交叉反应率为绿磺隆0.2796、嘧啶胺0.2％、邻2-乙氧基羧基苯磺酰胺2％、甲磺隆为3.2％、胺苯磺隆为4.8％、吡嘧磺隆为0.1％。
4土壤的有机质和有机溶剂对免疫反应的影响
实验表明对干扰影响比较明显的是有机质，有机溶剂添加实验表明在5％的添加量时丙酮对抗体抗原反应有影响，甲醇影响不大。
5样品回收率和土壤未知样品的测定
水样的添加回收率表明在81.2％-92.4％，土壤未知样品测定为3ng/kg与生物测定的相关性较好
Chlorimuron-methyl of hapten had been synthesized ,then the haptenwere covalentlyconjugatedtobovineserumlbulmin(BSA)orhumanserumalbumin(HAS)or valbumin(OVA)to prepare antigens(immunogens)and coating antigens , The conjugates identified and their molecular ration of hapten to carrier protein were idetermined by UV spectrophoto metry ,Sodium dodecyl-sulfatepolycrylamide Gel Eletrophoresis(SDS-PAGE)and white rabbits were immunized with sythetic antigens the antisera are speafic to chlorimuron-methyl were obtained by using CM-BSAthe middileand final titers were l:12500and 1:62500 for anti-CM setum . the enzyme tagged IgG were prepared by coupling horseradish perxidase (HRP) o IgG.The enzymeconjugate maintained both immunological activity and enzyme activity.
The half maximal inhibition to antibody antigen reaction were IC50 36.6ng/ml and limi of detection were IC2o0.7ng/ml for Chlorimuron-methyl. Cross-reactivities were determined for pyrazosulfaron metsulfuron-methylEthametsuIfuron-methyl chlorsulfuron was 0.1% , 3.2% 4.8% 0.27% Respectively,,
Postgraduate:wangqinghua Major:Pesticide science Tutor:Prof.cheng tiebao
1人工抗原的合成及鉴定
利用豆磺隆的特异性磺酰胺部位与琥珀酸酐反应制备半抗原，经熔点试验为167—169℃。利用活化脂法将BSA与半抗原连接制备免疫抗原；将OVA、HSA与半抗原连接制备包被抗原。通过紫外扫描；电泳法和琼脂双扩散法三种方法来鉴定连接方法，在免疫前可以通过紫外扫描和电泳方法来鉴定，在免疫后获得抗体利用琼脂双扩散进行鉴别抗原决定簇。
2豆磺隆ELISA试验条件
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3豆磺隆ELISA法分析标准曲线及特异性
在优化条件下豆磺隆ELISA标准曲线检测的线性范围是0.2—200ng/ml。回归方程为y=-0.3543x+1.2929检测限为0.7ng/ml，相关系数r~2=0.999。抑制率曲线方程是y=-0.0757x+0.2274r~2=0.9933 Ic50为36.6ng/ml。交叉反应率为绿磺隆0.2796、嘧啶胺0.2％、邻2-乙氧基羧基苯磺酰胺2％、甲磺隆为3.2％、胺苯磺隆为4.8％、吡嘧磺隆为0.1％。
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5样品回收率和土壤未知样品的测定
水样的添加回收率表明在81.2％-92.4％，土壤未知样品测定为3ng/kg与生物测定的相关性较好
Chlorimuron-methyl of hapten had been synthesized ,then the haptenwere covalentlyconjugatedtobovineserumlbulmin(BSA)orhumanserumalbumin(HAS)or valbumin(OVA)to prepare antigens(immunogens)and coating antigens , The conjugates identified and their molecular ration of hapten to carrier protein were idetermined by UV spectrophoto metry ,Sodium dodecyl-sulfatepolycrylamide Gel Eletrophoresis(SDS-PAGE)and white rabbits were immunized with sythetic antigens the antisera are speafic to chlorimuron-methyl were obtained by using CM-BSAthe middileand final titers were l:12500and 1:62500 for anti-CM setum . the enzyme tagged IgG were prepared by coupling horseradish perxidase (HRP) o IgG.The enzymeconjugate maintained both immunological activity and enzyme activity.
The half maximal inhibition to antibody antigen reaction were IC50 36.6ng/ml and limi of detection were IC2o0.7ng/ml for Chlorimuron-methyl. Cross-reactivities were determined for pyrazosulfaron metsulfuron-methylEthametsuIfuron-methyl chlorsulfuron was 0.1% , 3.2% 4.8% 0.27% Respectively,,
Postgraduate:wangqinghua Major:Pesticide science Tutor:Prof.cheng tiebao
引文
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7．陈锡岭，王桂莲 磺酰脲类除草剂的化学作用方式选择及降解特性河南职技师院学报1998年01期
8．邓安平，Franek Milam酶联免疫吸附分析法测定水样中的阿特拉津 分析化学1998 1：29-33
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18．蒋成金编著，《酶免疫测定法》人民卫生出版社，1984．3
李德平 磺酰脲类除草剂在土壤中的物理化学行为土壤1996年03期
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59. K L Hollaway, R S Kookana,D J Mcquinn comparison of suifonylurea herbicide residue detection in soil by bioassay, enzyme-linked immunosorbent assay and hplc. Weed Research 1999 39,383～397
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