枳PPF-1同源基因的克隆及表达特性分析
摘要
柑橘是我国的主栽果树之一。以枳(Poncirus trifoliata(L．)Raf．)为遗传资源培育抗性柑橘新种质是柑橘育种的主要内容之一。PPF-1是与开花、衰老及逆境有关的基因，本研究克隆了枳PPF-1同源基因PtPPF-1，并对其表达特性进行了分析。主要结果如下：
根据豌豆PPF-1、拟南芥ALBINO3的cDNA全长序列比对结果设计引物，通过RT-PCR及3′-RACE扩增得到了枳PPF-1同源基因的cDNA克隆片段(命名PtPPF-1)，该基因全长1493bp，编码一条长452个氨基酸残基的多肽，理论分子量为125.1kD，等电点为4.92。经蛋白结构预测发现其含有一个长为36个氨基酸残基的叶绿体定位信号域和五个跨膜结构域。氨基酸序列比对表明，PtPPF-1与豌豆PPF-1、拟南芥ALBINO3、水稻PPF-1相似性较高，与衣藻ALB3.2、性原细胞ALB3-1、绿领鞭藻类ALBINO3等同源蛋白相似性相对较低。
系统发育分析表明，PtPPF-1与豌豆PPF-1亲缘关系最近，其次为拟南芥ALBINO3和水稻PPF-1，四者同属一小族，说明PPF-1基因在进化过程中可能变异较小。
采用半定量RT-PCR对PtPPF-1的表达特性进行了分析。结果表明，PtPPF-1的表达量在枳叶片中最高，顶芽中次之，再次为茎，在根中没有检测到表达；而其红橘(Citrus tangerine Hort．ex Tanaka)的PPF-1同源基因在顶芽、叶片和茎中的表达没有差别。说明PtPPF-1的表达不仅具有组织特异性，而且种属间也存在差异。这可能与PtPPF-1基因含有叶绿体定位信号肽有关及枳抗性有关。
对不同植物生长调节剂处理枳叶中PtPPF-1表达情况进行了分析，结果表明GA_3、IAA、ABA促进了PtPPF-1的表达，KT对PtPPF-1的表达有抑制作用。推测GA_3、IAA、ABA信号通路可能与KT信号通路作用于PtPPF-1的表达存在不同的机制。PtPPF-1可能作为植物生长调节剂信号因子的一个下游信号元件存在，参与信号传导。
采用半定量RT-PCR对非生物胁迫(低温、干旱、盐)下枳的生理指标及PtPPF-1的表达情况进行了分析。结果表明，这三种胁迫都能诱导PtPPF-1的表达。说明PtPPF-1基因能响应这三种胁迫。SOD、POD活性在三种胁迫中均较高，CAT活性在三种胁迫中处于低水平；脯氨酸含量在三种胁迫中均表现为持续上升。三种胁迫中尤其是低温胁迫SOD、POD活性及脯氨酸含量的变化趋势与PtPPF-1的表达有很大的相似性，推测PtPPF-1基因可能与SOD、POD及脯氨酸之间存在一定的联系，并可以作为逆境胁迫标志物。
Citrus is one of the most important cultivating fruits in China. Now, one of the main studies of citrus breed is to study resistant breeds on Poncirus trifoliatha (L.) Raf. PPF-1 has been showed to involve in the regulation of flowering, senescence and responses to stresses. In the present study, we cloned the homologue gene of PPF-1 and primarily analyzed the expression pattern in Poncirus trifoliate, establishing theory foundation of breeding well citrus species.Primers used for RT-PCR and 3'-RACE were designed according to conserved sequences of Pea PPF-1 and Arabidopsis ALBINO3 cDNA sequences. A cDNA sequence from P. trifoliate was designated as PtPPF-1. The nucleotide sequence of PtPPF-1 was 1493 bp and encoded a protein of 452 amino acids with a logical molecular weight of 125.1 kDa and an isoelectric point of 4.92. There was a chloroplast localization signal domain at the leading side and five inner transmembrane domains in the protein of PtPPF-1.PtPPF-1 was high sequence similar to PPF-lof Pea, ALBINO3 of Arabidopsis and PPF-1 of Oryza, and was lower sequence similar to some putative proteins from Chlamydomonas, Gonium, Bigelowiella.Phylogenetic analysis showed that PtPPF-1 has highest homology to pea PPF-1, secondly Arabidopsis ALBINOS and then Oryza PPF-1, indicating little variation of PPF-1 genes in the evolution.RT-PCR revealed the higher expression level of PtPPF-1 both in leaves and in apical buds but almost non-detectable level in roots of P. trifoliata. As to the expression level of PtPPF-1 in Citrus tangerine Hort.ex Tanaka, it were on differences between that in leaves and in stems, both were lower than that in apical buds, and non-visible expression in roots. We presumed that the chloroplast localization signal domain maybe contributed to the PtPPF-1 expression.The expression of PtPPF-1 was also studied in P. trifoliata seedlings, which were treated by phytohormone (GA_3, IAA, ABA, KT) . The results indicated that treatments (GA_3, IAA, ABA) increased the expression of PtPPF-1 in leaves, and that of KT decreased the expression. There were different mechanisms which acted on PtPPF-1 between GA_3, IAA, ABA, and KT. After abiotic stresses treatment (cold, drought, salt) , the expression of PtPPF-1 increased obviously. Activities of SOD, POD maintained high level and that of CAT was low level when stress treatments (cold, drought, salt) began. The content of proline kept increasing during the three treatments. The trends of PtPPF-1 expression, activities of SOD, POD and the content of proline were similar in the treatments, especially cold treatment. And we proposed that there is some correlation between PtPPF-1 expression and SOD, POD, proline, and PtPPF-1 could act as an important symbol of stresses, especially cold stress.
根据豌豆PPF-1、拟南芥ALBINO3的cDNA全长序列比对结果设计引物，通过RT-PCR及3′-RACE扩增得到了枳PPF-1同源基因的cDNA克隆片段(命名PtPPF-1)，该基因全长1493bp，编码一条长452个氨基酸残基的多肽，理论分子量为125.1kD，等电点为4.92。经蛋白结构预测发现其含有一个长为36个氨基酸残基的叶绿体定位信号域和五个跨膜结构域。氨基酸序列比对表明，PtPPF-1与豌豆PPF-1、拟南芥ALBINO3、水稻PPF-1相似性较高，与衣藻ALB3.2、性原细胞ALB3-1、绿领鞭藻类ALBINO3等同源蛋白相似性相对较低。
系统发育分析表明，PtPPF-1与豌豆PPF-1亲缘关系最近，其次为拟南芥ALBINO3和水稻PPF-1，四者同属一小族，说明PPF-1基因在进化过程中可能变异较小。
采用半定量RT-PCR对PtPPF-1的表达特性进行了分析。结果表明，PtPPF-1的表达量在枳叶片中最高，顶芽中次之，再次为茎，在根中没有检测到表达；而其红橘(Citrus tangerine Hort．ex Tanaka)的PPF-1同源基因在顶芽、叶片和茎中的表达没有差别。说明PtPPF-1的表达不仅具有组织特异性，而且种属间也存在差异。这可能与PtPPF-1基因含有叶绿体定位信号肽有关及枳抗性有关。
对不同植物生长调节剂处理枳叶中PtPPF-1表达情况进行了分析，结果表明GA_3、IAA、ABA促进了PtPPF-1的表达，KT对PtPPF-1的表达有抑制作用。推测GA_3、IAA、ABA信号通路可能与KT信号通路作用于PtPPF-1的表达存在不同的机制。PtPPF-1可能作为植物生长调节剂信号因子的一个下游信号元件存在，参与信号传导。
采用半定量RT-PCR对非生物胁迫(低温、干旱、盐)下枳的生理指标及PtPPF-1的表达情况进行了分析。结果表明，这三种胁迫都能诱导PtPPF-1的表达。说明PtPPF-1基因能响应这三种胁迫。SOD、POD活性在三种胁迫中均较高，CAT活性在三种胁迫中处于低水平；脯氨酸含量在三种胁迫中均表现为持续上升。三种胁迫中尤其是低温胁迫SOD、POD活性及脯氨酸含量的变化趋势与PtPPF-1的表达有很大的相似性，推测PtPPF-1基因可能与SOD、POD及脯氨酸之间存在一定的联系，并可以作为逆境胁迫标志物。
Citrus is one of the most important cultivating fruits in China. Now, one of the main studies of citrus breed is to study resistant breeds on Poncirus trifoliatha (L.) Raf. PPF-1 has been showed to involve in the regulation of flowering, senescence and responses to stresses. In the present study, we cloned the homologue gene of PPF-1 and primarily analyzed the expression pattern in Poncirus trifoliate, establishing theory foundation of breeding well citrus species.Primers used for RT-PCR and 3'-RACE were designed according to conserved sequences of Pea PPF-1 and Arabidopsis ALBINO3 cDNA sequences. A cDNA sequence from P. trifoliate was designated as PtPPF-1. The nucleotide sequence of PtPPF-1 was 1493 bp and encoded a protein of 452 amino acids with a logical molecular weight of 125.1 kDa and an isoelectric point of 4.92. There was a chloroplast localization signal domain at the leading side and five inner transmembrane domains in the protein of PtPPF-1.PtPPF-1 was high sequence similar to PPF-lof Pea, ALBINO3 of Arabidopsis and PPF-1 of Oryza, and was lower sequence similar to some putative proteins from Chlamydomonas, Gonium, Bigelowiella.Phylogenetic analysis showed that PtPPF-1 has highest homology to pea PPF-1, secondly Arabidopsis ALBINOS and then Oryza PPF-1, indicating little variation of PPF-1 genes in the evolution.RT-PCR revealed the higher expression level of PtPPF-1 both in leaves and in apical buds but almost non-detectable level in roots of P. trifoliata. As to the expression level of PtPPF-1 in Citrus tangerine Hort.ex Tanaka, it were on differences between that in leaves and in stems, both were lower than that in apical buds, and non-visible expression in roots. We presumed that the chloroplast localization signal domain maybe contributed to the PtPPF-1 expression.The expression of PtPPF-1 was also studied in P. trifoliata seedlings, which were treated by phytohormone (GA_3, IAA, ABA, KT) . The results indicated that treatments (GA_3, IAA, ABA) increased the expression of PtPPF-1 in leaves, and that of KT decreased the expression. There were different mechanisms which acted on PtPPF-1 between GA_3, IAA, ABA, and KT. After abiotic stresses treatment (cold, drought, salt) , the expression of PtPPF-1 increased obviously. Activities of SOD, POD maintained high level and that of CAT was low level when stress treatments (cold, drought, salt) began. The content of proline kept increasing during the three treatments. The trends of PtPPF-1 expression, activities of SOD, POD and the content of proline were similar in the treatments, especially cold treatment. And we proposed that there is some correlation between PtPPF-1 expression and SOD, POD, proline, and PtPPF-1 could act as an important symbol of stresses, especially cold stress.
引文
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