人工栽培蛹虫草（Cordyceps militaris）性状变异的遗传学分析
摘要
蛹虫草Cordyceps militaris（L.）Link为虫草属食、药用真菌，它可以代替冬虫夏草入药。而在人工驯化栽培过程中，蛹虫草菌种的退化现象比较严重，目前对虫草属真菌的研究只限于菌种的鉴定、营养成分分析、药用价值研究及人工栽培等。用常规选育方法虽然能减少一定的损失，但不能从根本上解决菌种退化这一长期困扰企业生产的问题。针对菌种退化问题，主要是利用有性循环、原生质体融合和遗传工程等途径进行菌株改良，应用分子生物学手段只是研究种内、种间的系统关系等，而关于菌种退化遗传机理的研究尚未见报道。菌种退化是菌类栽培过程中普遍存在的，也是生产当中迫切希望得到解决的问题。
本实验中，运用RFLP和RAPD两种分子标记技术及同工酶分析技术对正常菌株和其退化菌株进行了DNA和蛋白质水平的分析，以期获得表型性状的变化所涉及的DNA和蛋白质水平的标记。PCR-RFLP实验，采用真菌通用引物ITS1和ITS4，扩增出5.8S和其两端的两个转录间隔区（ITS），选用5种识别四个碱基的内切酶（HaeⅢ、AfaⅠ、TagⅠ、AluⅠ和XspⅠ）进行酶切，其中只有XspⅠ酶切结果在两个菌种中存在差异，进一步测序表明，整个片段全长534bp，共有13个位点发生碱基突变，且都为c转换为t。野生驯化菌株的测序结果与 Genbank中检索到的序列顺序一致。RAPD实验，选用Operon公司的4组（G组、H组、L组、M组）计80个随机引物进行PCR扩增，共筛选出9个对所有供试个体均存在明显差异的引物。由这9种引物计算所得的菌株间的相似系数为：OPG9:28.6%;OPH4：44.4%；OPH12：33.3%；OPL1：50%；OPL9：40%；OPM2：33.3%；OPM17：57.1%；OPM19：72.7%；OPG13为0，其中最大值为72.7% ，平均值为39.9%，结果表明了退化菌株较野生驯化菌株在DNA水平上发生了频率较高的突变，这些突变可能与菌种退化的基因相关联。
采用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术对菌丝体阶段的蛹虫草Cordyceps militaris (L.)Link及其退化菌株进行了同工酶分析。共检测了酯酶（EST）、过氧化物酶(PER)、超氧化物歧化酶(SOD)、苹果酸酶(ME)、苹果酸脱氢酶(MDH)、谷氨酸脱氢酶(GDH)、乙醇脱氢酶(ADH)、细胞色素氧化酶共计8种同工酶，其中酯酶、超氧化物歧化酶、苹果酸酶、苹果酸脱氢酶在正常菌株和退化菌株中出现了明显的差异。而其余四种酶在正常菌株和退化菌株中酶谱一致。本研究不仅可以作为菌株退化早期鉴别的手段之一，而且为进一步研究菌种退化遗传机理提供了蛋白质水平上的一些理论依据。
Cordyceps militaris(L.)Link is one of the most important fungus in cordyceps genus.It can replace the Cordyceps sinensis in diet and traditional Chinese medicine. In the artificial-planting,the strain of Cordyceps militaris is easy to degenerate.At present,the study about the fungus in Cordyceps Genus are just in the identification of fungi、the nutrition analysis、the using in medicine and artificial-planting.Although,it could reduce the lost by the usual breeding way,we could not solve the problem at basic.About the degeneration of strain,people mostly use the gender-cycling、the fusing-cytoplasmic technology and the genetic-engineering method to reform the strain.Most of people use moleculor method in the study of relationships among the species and between the species. We did not find none of the articles report about the genetic and degenerative mechanism.The degeneration of strain is common in artificial-planting,it is one of the most urgent problems that need to solve.
In this experiment, PCR-RFLP and RAPD , were used to study the level of differences in gene of naturalized Cordyceps militaris and its degenerative strain.By using PCR-RFLP,5.8S and its two ITS regions were amplified and digested with five restriction enzymes (HaeⅢ、AfaⅠ、TagⅠ、AluⅠand XspⅠ).The sequencing results showed the length of 5.8S and ITS region is534bp and there are 13mutant bases.The sequence ofnaturalized strain is the same with the sequence searching in the Genbank.Of 80primers,9ones generated reproducible RAPDprofiles.From these 9primers we getthesimilar-ratio: betweenthenaturalizedCordycepsmilitarisanditsdegenerativestrain:OPG9:28.6%;OPH4:44.4%;OPH12:33.3%;OPL1:50%;OPL9:40%;OPM2:33.3%;OPM17:57.1%;OPM19:72.7%;OPG13:0. The maxim is 72.7% ,the average is 39.9%.The results showed the degenerative strain gene rated high frequency mutation.
The mutation may associate with the gene which resulted in degeneration of the strain .The isozymes of the Cordyceps militaris and its degenerative strain on the stage of mycelia were analysed by polycrylancide gel electrophoresis. The tested isozymes included esterase(EST)、superoxide dismutase(SOD)、Malate.dehydrogenase(MDH)、malic enzyme(ME)、Glutamate dehydrogenase(GDH)、peroxidase(PER) and alcohol dehydrogenase(ADH).There were obvious differences between the normal strain and its degenerative strain in EST、MDH、ME、SOD.The zymotype were the same in the other isozymes.The results were not only used to test the degenerative strain at young stage ,but also as the theoretical base to study the genetic mechanism of the degenerative strain.
本实验中，运用RFLP和RAPD两种分子标记技术及同工酶分析技术对正常菌株和其退化菌株进行了DNA和蛋白质水平的分析，以期获得表型性状的变化所涉及的DNA和蛋白质水平的标记。PCR-RFLP实验，采用真菌通用引物ITS1和ITS4，扩增出5.8S和其两端的两个转录间隔区（ITS），选用5种识别四个碱基的内切酶（HaeⅢ、AfaⅠ、TagⅠ、AluⅠ和XspⅠ）进行酶切，其中只有XspⅠ酶切结果在两个菌种中存在差异，进一步测序表明，整个片段全长534bp，共有13个位点发生碱基突变，且都为c转换为t。野生驯化菌株的测序结果与 Genbank中检索到的序列顺序一致。RAPD实验，选用Operon公司的4组（G组、H组、L组、M组）计80个随机引物进行PCR扩增，共筛选出9个对所有供试个体均存在明显差异的引物。由这9种引物计算所得的菌株间的相似系数为：OPG9:28.6%;OPH4：44.4%；OPH12：33.3%；OPL1：50%；OPL9：40%；OPM2：33.3%；OPM17：57.1%；OPM19：72.7%；OPG13为0，其中最大值为72.7% ，平均值为39.9%，结果表明了退化菌株较野生驯化菌株在DNA水平上发生了频率较高的突变，这些突变可能与菌种退化的基因相关联。
采用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术对菌丝体阶段的蛹虫草Cordyceps militaris (L.)Link及其退化菌株进行了同工酶分析。共检测了酯酶（EST）、过氧化物酶(PER)、超氧化物歧化酶(SOD)、苹果酸酶(ME)、苹果酸脱氢酶(MDH)、谷氨酸脱氢酶(GDH)、乙醇脱氢酶(ADH)、细胞色素氧化酶共计8种同工酶，其中酯酶、超氧化物歧化酶、苹果酸酶、苹果酸脱氢酶在正常菌株和退化菌株中出现了明显的差异。而其余四种酶在正常菌株和退化菌株中酶谱一致。本研究不仅可以作为菌株退化早期鉴别的手段之一，而且为进一步研究菌种退化遗传机理提供了蛋白质水平上的一些理论依据。
Cordyceps militaris(L.)Link is one of the most important fungus in cordyceps genus.It can replace the Cordyceps sinensis in diet and traditional Chinese medicine. In the artificial-planting,the strain of Cordyceps militaris is easy to degenerate.At present,the study about the fungus in Cordyceps Genus are just in the identification of fungi、the nutrition analysis、the using in medicine and artificial-planting.Although,it could reduce the lost by the usual breeding way,we could not solve the problem at basic.About the degeneration of strain,people mostly use the gender-cycling、the fusing-cytoplasmic technology and the genetic-engineering method to reform the strain.Most of people use moleculor method in the study of relationships among the species and between the species. We did not find none of the articles report about the genetic and degenerative mechanism.The degeneration of strain is common in artificial-planting,it is one of the most urgent problems that need to solve.
In this experiment, PCR-RFLP and RAPD , were used to study the level of differences in gene of naturalized Cordyceps militaris and its degenerative strain.By using PCR-RFLP,5.8S and its two ITS regions were amplified and digested with five restriction enzymes (HaeⅢ、AfaⅠ、TagⅠ、AluⅠand XspⅠ).The sequencing results showed the length of 5.8S and ITS region is534bp and there are 13mutant bases.The sequence ofnaturalized strain is the same with the sequence searching in the Genbank.Of 80primers,9ones generated reproducible RAPDprofiles.From these 9primers we getthesimilar-ratio: betweenthenaturalizedCordycepsmilitarisanditsdegenerativestrain:OPG9:28.6%;OPH4:44.4%;OPH12:33.3%;OPL1:50%;OPL9:40%;OPM2:33.3%;OPM17:57.1%;OPM19:72.7%;OPG13:0. The maxim is 72.7% ,the average is 39.9%.The results showed the degenerative strain gene rated high frequency mutation.
The mutation may associate with the gene which resulted in degeneration of the strain .The isozymes of the Cordyceps militaris and its degenerative strain on the stage of mycelia were analysed by polycrylancide gel electrophoresis. The tested isozymes included esterase(EST)、superoxide dismutase(SOD)、Malate.dehydrogenase(MDH)、malic enzyme(ME)、Glutamate dehydrogenase(GDH)、peroxidase(PER) and alcohol dehydrogenase(ADH).There were obvious differences between the normal strain and its degenerative strain in EST、MDH、ME、SOD.The zymotype were the same in the other isozymes.The results were not only used to test the degenerative strain at young stage ,but also as the theoretical base to study the genetic mechanism of the degenerative strain.
引文
[1] 王中仁. 植物等位酶分析. 北京：科学出版社，1998.
[2] 阎培生，罗信昌，周启 . 木耳属真菌rDNA特异性扩增片段的RFLP研究. 菌物系统，1999,18(2):206～213.
[3] 骆志成，王瑞礼，李若瑜等 .烟曲霉rDNA基因ITS区的克隆测序分析. 菌物系统，2000,19,(3):336～341.
[4] 康冀川，梁宗琦，刘爱英等.虫草多型现象的5.8SrDNA和ITS2序列测定研究. 菌物系统，2000,19,(4):492～497.
[5] 朱衡，翟峰，朱立煌 . 利用氯化苄提取适于分子生物学分析的真菌DNA. 真菌学报，1994,13,(4):34～40.
[6] 何月秋. 真菌菌丝体培养和提取DNA方法的改进. 真菌学报，2000,19,(4):434.
[7] Raul Rivas,Nieves Vizcaino,Ruben M.Buey etal An effective ,rapid and simple method for total RNA extration from bacteria and yeast Jouranl of Microbiological Methods,2001 ,(47):59～63.
[8]J.萨姆布鲁克，E.F.弗里奇，T. 曼尼阿蒂斯.分子克隆实验指南. 北京：科学出版社，1999.
[9] 穆里斯（K.B.Mullis）等著. 聚合酶链式反应. 北京：科学出版社，1997.
[10] 胡能书，万国贤. 同工酶技术与应用. 长沙：湖南科学出版社，1985.
[11] 季维智，宿兵. 遗传多样性研究的原理与方法. 浙江科学技术出版社，1999.
[12] 葛颂，洪德元. 泡桐参同工酶基因位点的遗传分析. 植物学报，1996，38,(6):431～438.
[13] Dover GA,Coen E,Spring cleaning ribosomal DNA:a model for multigene evolution? Nature, 1981, 290:731～732.
[14] Hillis DM,Davis SK,Evolution of ribosomal DNA:Fifty million years of recorded history in the frog genus Rana.Evolution ,1986, 40:1275.
[15] Kominami R,Organization of ribosomal RNA gene repeats of the mouse .Nucleic Acid Res,1981, 9:3219.
[16] Suzuki H etal Variation in the distribution of silver staining nucleoclear organizer region on the chromosomes of the wild mouse Mus musculus.Mol.Biol.Evol,1990 ,7:271～282
[17] Suzuki H etal.Differentiation of restriction sites in ribosomal DNA in the genus Apademus.Biochem.Genet,1990,28:137.
[18] 兰宏，施立明，铃木仁.麂属rRNA限制性位点多态性及其系统进化。科学通报,1993 ,38:1116～1119.
[19] 孙乃恩，孙东旭，朱德煦 .分子遗传学 .江苏：南京大学出版社, 1990.
[20] Jianchi Chen,Donna Banks,Robert L.etal .Use of 16S rRNA Sequences as signature Characters to Identify Xylella fastidiosa.Current Microbiology ,2000,40:29～33.
[21] Kazuya Watanabe,Yumiko Kodama,Shigeaki Harayama,Design and evaluation of RCR primers to amplify bacterial 16S ribosomal DNA fragments used for community fingerprinting. Journal of Microbiological Methods ,2001,(44):253～262.
[22] George M.Siboe,Johanne Murray,Paul M.Kirk Genetic similarity among Cercospora apii-group species and their detection in host plant tissue by PCR/RFLP analyses of the rDNA internal transcribed spacer(ITS)
J,Gen.Appl.Microbiol ,2000,(46):69～78
[23] Magae Y,Hayashi N. Double-stranded RNA and virus-like particles in the edible basidiomycete Flammulima velutipes(Enokitake). FEMS Microbiology Letters,1999,180:331～335.
[24] Chen CK,Blaschek HP. Effect of acetate on molecular and physiological aspects of Clostridium beijerinckii NCIMB8052 solvent production and strain degeneration. Applied ＆ Environmental Microbiology,1999,65:499～505.
[25] Hemachandra L,Paul H,Victoria F,etal.A new Insertion Sequence,ISCb1,from Clostridium beijerinckii NCIMB 8052. Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology,2000,2:107～113.
[26] 胡志昂，张亚平 .中国动植物的遗传多样性. 浙江科学技术出版社 ,1997.
[27] 边银丙，罗信昌，周启 .木耳栽培菌株酯酶同工酶的酶谱多样性研究 .菌物系统,2000 ,19(1):87～90.
[28] 范俊 王淑珍，高雁. 松茸过氧化物酶和酯酶同工酶的研究 .食用菌, 2001,12(5):6～7.
[29] 李荣春. 双孢蘑菇分子标记研究进展. 微生物学通报，2002,29(2): 64～67.
[30] 边银丙，吴康云，伍昌胜. 黑木耳种内杂交子同工酶基因座的遗传分析. 遗传学报，2003,30(1):76～80.
[31] 吴康云，边银丙. 黑木耳种内杂交子的鉴定技术. 菌物系统，2002,21(2): 210～214.
[32] 刘琳，肖光辉，肖晓玲 酯酶和苹果酸脱氢酶同工酶分析用于香菇原种的鉴定. 湖南农业科学, 2000,(3): 51～53.
[33] 党建章，徐旭士，程为民，茶新菇不同生长期同工酶的研究 .中国食用菌,
2001, 20(1):41～43.
[34] 陆文清，李德发，潘宝海等. 高产菌种的退化及其防治. 饲料与添加剂，2001,(1):45～46.
[35] 潘迎捷，汪昭月，龚胜萍等. 香菇菌种退化的遗传分析. 食用菌，1991,(2): 12～13.
[36] 唐小庆，糖燕平，李增智 球孢白僵菌菌种退化及其对马尾松毛虫防治的影响. 安徽农业大学学报, 1996, 23(3):246～253.
[37] 方志刚，张立钦，刘军. 主要虫生真菌的分子生物学研究进展. 南京农业大学学报，2001,25(2):63～67.
[38]藏穆，刘道庆，胡若瑛.中国虫草菌属亚属的划分及新种报道. 云南植物研究，1982，4(2)：173～176.
[39]Liu B,Yuan PG,Cao JZ et al.A new species of Cordyceps from China.真菌学报，1984，3(4):192～195.
[40]刘波，荣福雄，靳红顺. 虫草属一新种. 武汉植物学研究，1985，3(3):23～24.
[41]Zhang KY,Wang CJ,Yan MS.A new species of Cordyceps from Gansu.Trans. Mycol.Soc.Japan,1989,30:295～299.
[42]Zang M,Yang DR,Li CD.A new taxa in the genus Cordyceps from China..Mycotaxon,1990,(37):57～62.
[43]Zang M,Kinjo N.Notes on the alpine Cordyceps of China and nearby nations . Mycotaxon,1998,(66):215～229.
[44]梁宗琦，刘爱英，刘杰麟. 虫草一新种及其绿僵菌无性型. 真菌学报, 1991，10(3):172～180.
[45]梁宗琦，刘爱英，黄建忠等.宽阔水自然保护区的虫草及其相关真菌Ⅰ.真菌学报，1996 ,15(4):264～ 271.
[46] 梁宗琦，刘爱英，黄建忠等. 宽阔水自然保护区的虫草及其相关真菌Ⅱ. 菌物系统，1997，16(1):61～67.
[47] 刘爱英，梁宗琦，刘作易. 峨眉山自然保护区的虫草及其它昆虫病原真菌Ⅰ.菌物系统，1997，
16(2):139～143.
[48] Liu ZY,Liang ZQ.A new species of the genus Cordyceps growing on white crub.菌物系统，1997,16(1):4～8.
[49] 刘作易，梁宗琦，刘爱英. 采集自贵州的两个稀有虫草. 菌物系统，1997,16(2):97～101.
[50] Liang ZY,Liang ZQ.A new species of Paceliomyces isolated from Cordyceps odonatae. Mycosystema, 1995～1996 ,8～9;83～87.
[51] 林树钱，余美兰. 人工虫草的研究和开发现状. 中国食用菌,1997, 16(1):5～7.
[52]梁宗琦 .一种国内未见的虫草菌—古尼虫草 真菌学报，1983,2(4):258～259.
[53] 陈顺龙. 冬虫夏草和北虫草研究进展. 中国生化药物杂志, 1995, 16(5):242～244.
[54] 梁宗琦. 我国虫草属真菌研究开发的现状及思考. 2001, 8(2):53～62.
[55] 梁宗琦，刘爱英. 中国药用真菌学 北京：中国协和医科大学联合出版社，1997.
[56] 李淑芳，鲍淑娟，林文琴. 古尼拟青霉抗癌作用的实验研究. 贵阳医学院学报，1996,21(1):16.
[57]朱振元，梁宗琦，刘爱英. 小分子多肽的镇痛作用及其生物来源. 山地农业生物学报, 1999,18(3):195～199.
[58]黄建忠，梁宗琦，刘爱英. 粉被虫草无性型对苏芸金杆菌抗紫外线辐射的保护效应 .西南农业学报，1992,5(2):63～67.
[59]刘杰麟. 粉被虫草多糖对免疫功能的作用. 中国医药学报，1997,12:158～159.
[60] 刘杰麟,童宜英. 粉被虫草菌丝体发酵液对发射损伤小鼠体液免疫的作用. 中华放射医学与防护杂志，1999,19(2):111.
[61] 焦彦朝，梁宗琦，刘爱英. 戴氏虫草无性型的研究Ⅰ抗生素. 西南农业学报，1992,5(4):46～48.
[62] 焦彦朝，梁宗琦，刘爱英. 戴氏虫草无性型的研究Ⅱ多糖. 西南农业学报，1993,6(6):27～32.
[63] 郭锡勇，郭莉莉，陈芳. 戴氏虫草与冬虫夏草化学成分的比较. 中药材, 1995，18(8):403～404.
[64]刘杰麟，查筑红，童宜英. 戴氏虫草菌丝体水提物对γ射线辐射损伤小鼠免疫功能的保护作用. 中国医药学报，1998，13：502～503.
[65]刘杰麟，程萍. 戴氏虫草提纯物对小鼠免疫功能和对肿瘤细胞的抑制作用. 细胞与分子免疫学杂志，1999,15:9～11.
[66] 张显科，刘文霞 蛹虫草化学成份测定 .菌物系统,1997, 16(1):78～80.
[67] 郭文场,李训德. 辽宁吉林虫草属（Cordyceps）真菌与蛹虫草的利用.特种经济动植物,2001,(4):13.
[68] 葛蓓蕾 江晓路.北虫草的研究现状.中国食用菌, 1999, 18(1):26～27.
[69] Young-Joon,Ahn,Suck-JoonPark,Sang-Gil Lee,etal. Cordycepin:Selective Growth Inhibitor Derived from Liquid Culture of Cordyceps militaris against Clostridium spp.J.Agric. Food Chem,2000 ,48: 2744～2748.
[70] 刘彦平，张玉叶，刘芳.冬虫夏草对老龄小鼠免疫功能的调整作用.中国老年学杂志, 2001,1(9):375～376.
[71] 董妙珠，叶于薇，杨隽等.虫草制品对小鼠免疫功能和血糖调节影响的研究.中国食品卫生杂志,2001,13(5):8～10.
[72] Jong-Ho,Koh,Kwang-Won,Yu,Hyung-Joo Suh.Activation of Macrophages and the Intestinal Immune System by an Orally Administered Decoction from Cultured Mycelia of Cordyceps sinensis .Biosci.Biotechnol.Biochem ,2002,66(2):407～411.
[73] Yuh-Chi Kuo,Wei-Jern T,sai,Jir-Yenn Wang,etal. Regulation of bronchoalveolar lavage fluids cell function by the immunomodulatory agents from Cordyceps sinesis.Life Sciences,2001, 68:1067～1082.
[74] Yue-QinChen,NingWang,Liang-Hu Qu,etal Determination of the anamorph of Cordyceps sinensis inferred from the analysis of the ribosomal DNA internal transcribed spacers and 5.8S rDNA. Biochemicla Systematics and Ecology .2001, 29 :597～607.
[75] 张云武，陈永久，沈发荣等. 滇西北地区冬虫夏草和阔孢虫草的遗传分化研究. 菌物系统, 1999 ,,18(2):176～183.
[76] 马富英，罗信昌. 分子标记在食用覃菌遗传育种中的应用. 菌物系统,2002 ,21(1):147～151.
[77] 郭春沅. RFLP，RAPD技术在食用菌研究中的应用. 中国食用菌, 2000,18(5):3～4.
[2] 阎培生，罗信昌，周启 . 木耳属真菌rDNA特异性扩增片段的RFLP研究. 菌物系统，1999,18(2):206～213.
[3] 骆志成，王瑞礼，李若瑜等 .烟曲霉rDNA基因ITS区的克隆测序分析. 菌物系统，2000,19,(3):336～341.
[4] 康冀川，梁宗琦，刘爱英等.虫草多型现象的5.8SrDNA和ITS2序列测定研究. 菌物系统，2000,19,(4):492～497.
[5] 朱衡，翟峰，朱立煌 . 利用氯化苄提取适于分子生物学分析的真菌DNA. 真菌学报，1994,13,(4):34～40.
[6] 何月秋. 真菌菌丝体培养和提取DNA方法的改进. 真菌学报，2000,19,(4):434.
[7] Raul Rivas,Nieves Vizcaino,Ruben M.Buey etal An effective ,rapid and simple method for total RNA extration from bacteria and yeast Jouranl of Microbiological Methods,2001 ,(47):59～63.
[8]J.萨姆布鲁克，E.F.弗里奇，T. 曼尼阿蒂斯.分子克隆实验指南. 北京：科学出版社，1999.
[9] 穆里斯（K.B.Mullis）等著. 聚合酶链式反应. 北京：科学出版社，1997.
[10] 胡能书，万国贤. 同工酶技术与应用. 长沙：湖南科学出版社，1985.
[11] 季维智，宿兵. 遗传多样性研究的原理与方法. 浙江科学技术出版社，1999.
[12] 葛颂，洪德元. 泡桐参同工酶基因位点的遗传分析. 植物学报，1996，38,(6):431～438.
[13] Dover GA,Coen E,Spring cleaning ribosomal DNA:a model for multigene evolution? Nature, 1981, 290:731～732.
[14] Hillis DM,Davis SK,Evolution of ribosomal DNA:Fifty million years of recorded history in the frog genus Rana.Evolution ,1986, 40:1275.
[15] Kominami R,Organization of ribosomal RNA gene repeats of the mouse .Nucleic Acid Res,1981, 9:3219.
[16] Suzuki H etal Variation in the distribution of silver staining nucleoclear organizer region on the chromosomes of the wild mouse Mus musculus.Mol.Biol.Evol,1990 ,7:271～282
[17] Suzuki H etal.Differentiation of restriction sites in ribosomal DNA in the genus Apademus.Biochem.Genet,1990,28:137.
[18] 兰宏，施立明，铃木仁.麂属rRNA限制性位点多态性及其系统进化。科学通报,1993 ,38:1116～1119.
[19] 孙乃恩，孙东旭，朱德煦 .分子遗传学 .江苏：南京大学出版社, 1990.
[20] Jianchi Chen,Donna Banks,Robert L.etal .Use of 16S rRNA Sequences as signature Characters to Identify Xylella fastidiosa.Current Microbiology ,2000,40:29～33.
[21] Kazuya Watanabe,Yumiko Kodama,Shigeaki Harayama,Design and evaluation of RCR primers to amplify bacterial 16S ribosomal DNA fragments used for community fingerprinting. Journal of Microbiological Methods ,2001,(44):253～262.
[22] George M.Siboe,Johanne Murray,Paul M.Kirk Genetic similarity among Cercospora apii-group species and their detection in host plant tissue by PCR/RFLP analyses of the rDNA internal transcribed spacer(ITS)
J,Gen.Appl.Microbiol ,2000,(46):69～78
[23] Magae Y,Hayashi N. Double-stranded RNA and virus-like particles in the edible basidiomycete Flammulima velutipes(Enokitake). FEMS Microbiology Letters,1999,180:331～335.
[24] Chen CK,Blaschek HP. Effect of acetate on molecular and physiological aspects of Clostridium beijerinckii NCIMB8052 solvent production and strain degeneration. Applied ＆ Environmental Microbiology,1999,65:499～505.
[25] Hemachandra L,Paul H,Victoria F,etal.A new Insertion Sequence,ISCb1,from Clostridium beijerinckii NCIMB 8052. Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology,2000,2:107～113.
[26] 胡志昂，张亚平 .中国动植物的遗传多样性. 浙江科学技术出版社 ,1997.
[27] 边银丙，罗信昌，周启 .木耳栽培菌株酯酶同工酶的酶谱多样性研究 .菌物系统,2000 ,19(1):87～90.
[28] 范俊 王淑珍，高雁. 松茸过氧化物酶和酯酶同工酶的研究 .食用菌, 2001,12(5):6～7.
[29] 李荣春. 双孢蘑菇分子标记研究进展. 微生物学通报，2002,29(2): 64～67.
[30] 边银丙，吴康云，伍昌胜. 黑木耳种内杂交子同工酶基因座的遗传分析. 遗传学报，2003,30(1):76～80.
[31] 吴康云，边银丙. 黑木耳种内杂交子的鉴定技术. 菌物系统，2002,21(2): 210～214.
[32] 刘琳，肖光辉，肖晓玲 酯酶和苹果酸脱氢酶同工酶分析用于香菇原种的鉴定. 湖南农业科学, 2000,(3): 51～53.
[33] 党建章，徐旭士，程为民，茶新菇不同生长期同工酶的研究 .中国食用菌,
2001, 20(1):41～43.
[34] 陆文清，李德发，潘宝海等. 高产菌种的退化及其防治. 饲料与添加剂，2001,(1):45～46.
[35] 潘迎捷，汪昭月，龚胜萍等. 香菇菌种退化的遗传分析. 食用菌，1991,(2): 12～13.
[36] 唐小庆，糖燕平，李增智 球孢白僵菌菌种退化及其对马尾松毛虫防治的影响. 安徽农业大学学报, 1996, 23(3):246～253.
[37] 方志刚，张立钦，刘军. 主要虫生真菌的分子生物学研究进展. 南京农业大学学报，2001,25(2):63～67.
[38]藏穆，刘道庆，胡若瑛.中国虫草菌属亚属的划分及新种报道. 云南植物研究，1982，4(2)：173～176.
[39]Liu B,Yuan PG,Cao JZ et al.A new species of Cordyceps from China.真菌学报，1984，3(4):192～195.
[40]刘波，荣福雄，靳红顺. 虫草属一新种. 武汉植物学研究，1985，3(3):23～24.
[41]Zhang KY,Wang CJ,Yan MS.A new species of Cordyceps from Gansu.Trans. Mycol.Soc.Japan,1989,30:295～299.
[42]Zang M,Yang DR,Li CD.A new taxa in the genus Cordyceps from China..Mycotaxon,1990,(37):57～62.
[43]Zang M,Kinjo N.Notes on the alpine Cordyceps of China and nearby nations . Mycotaxon,1998,(66):215～229.
[44]梁宗琦，刘爱英，刘杰麟. 虫草一新种及其绿僵菌无性型. 真菌学报, 1991，10(3):172～180.
[45]梁宗琦，刘爱英，黄建忠等.宽阔水自然保护区的虫草及其相关真菌Ⅰ.真菌学报，1996 ,15(4):264～ 271.
[46] 梁宗琦，刘爱英，黄建忠等. 宽阔水自然保护区的虫草及其相关真菌Ⅱ. 菌物系统，1997，16(1):61～67.
[47] 刘爱英，梁宗琦，刘作易. 峨眉山自然保护区的虫草及其它昆虫病原真菌Ⅰ.菌物系统，1997，
16(2):139～143.
[48] Liu ZY,Liang ZQ.A new species of the genus Cordyceps growing on white crub.菌物系统，1997,16(1):4～8.
[49] 刘作易，梁宗琦，刘爱英. 采集自贵州的两个稀有虫草. 菌物系统，1997,16(2):97～101.
[50] Liang ZY,Liang ZQ.A new species of Paceliomyces isolated from Cordyceps odonatae. Mycosystema, 1995～1996 ,8～9;83～87.
[51] 林树钱，余美兰. 人工虫草的研究和开发现状. 中国食用菌,1997, 16(1):5～7.
[52]梁宗琦 .一种国内未见的虫草菌—古尼虫草 真菌学报，1983,2(4):258～259.
[53] 陈顺龙. 冬虫夏草和北虫草研究进展. 中国生化药物杂志, 1995, 16(5):242～244.
[54] 梁宗琦. 我国虫草属真菌研究开发的现状及思考. 2001, 8(2):53～62.
[55] 梁宗琦，刘爱英. 中国药用真菌学 北京：中国协和医科大学联合出版社，1997.
[56] 李淑芳，鲍淑娟，林文琴. 古尼拟青霉抗癌作用的实验研究. 贵阳医学院学报，1996,21(1):16.
[57]朱振元，梁宗琦，刘爱英. 小分子多肽的镇痛作用及其生物来源. 山地农业生物学报, 1999,18(3):195～199.
[58]黄建忠，梁宗琦，刘爱英. 粉被虫草无性型对苏芸金杆菌抗紫外线辐射的保护效应 .西南农业学报，1992,5(2):63～67.
[59]刘杰麟. 粉被虫草多糖对免疫功能的作用. 中国医药学报，1997,12:158～159.
[60] 刘杰麟,童宜英. 粉被虫草菌丝体发酵液对发射损伤小鼠体液免疫的作用. 中华放射医学与防护杂志，1999,19(2):111.
[61] 焦彦朝，梁宗琦，刘爱英. 戴氏虫草无性型的研究Ⅰ抗生素. 西南农业学报，1992,5(4):46～48.
[62] 焦彦朝，梁宗琦，刘爱英. 戴氏虫草无性型的研究Ⅱ多糖. 西南农业学报，1993,6(6):27～32.
[63] 郭锡勇，郭莉莉，陈芳. 戴氏虫草与冬虫夏草化学成分的比较. 中药材, 1995，18(8):403～404.
[64]刘杰麟，查筑红，童宜英. 戴氏虫草菌丝体水提物对γ射线辐射损伤小鼠免疫功能的保护作用. 中国医药学报，1998，13：502～503.
[65]刘杰麟，程萍. 戴氏虫草提纯物对小鼠免疫功能和对肿瘤细胞的抑制作用. 细胞与分子免疫学杂志，1999,15:9～11.
[66] 张显科，刘文霞 蛹虫草化学成份测定 .菌物系统,1997, 16(1):78～80.
[67] 郭文场,李训德. 辽宁吉林虫草属（Cordyceps）真菌与蛹虫草的利用.特种经济动植物,2001,(4):13.
[68] 葛蓓蕾 江晓路.北虫草的研究现状.中国食用菌, 1999, 18(1):26～27.
[69] Young-Joon,Ahn,Suck-JoonPark,Sang-Gil Lee,etal. Cordycepin:Selective Growth Inhibitor Derived from Liquid Culture of Cordyceps militaris against Clostridium spp.J.Agric. Food Chem,2000 ,48: 2744～2748.
[70] 刘彦平，张玉叶，刘芳.冬虫夏草对老龄小鼠免疫功能的调整作用.中国老年学杂志, 2001,1(9):375～376.
[71] 董妙珠，叶于薇，杨隽等.虫草制品对小鼠免疫功能和血糖调节影响的研究.中国食品卫生杂志,2001,13(5):8～10.
[72] Jong-Ho,Koh,Kwang-Won,Yu,Hyung-Joo Suh.Activation of Macrophages and the Intestinal Immune System by an Orally Administered Decoction from Cultured Mycelia of Cordyceps sinensis .Biosci.Biotechnol.Biochem ,2002,66(2):407～411.
[73] Yuh-Chi Kuo,Wei-Jern T,sai,Jir-Yenn Wang,etal. Regulation of bronchoalveolar lavage fluids cell function by the immunomodulatory agents from Cordyceps sinesis.Life Sciences,2001, 68:1067～1082.
[74] Yue-QinChen,NingWang,Liang-Hu Qu,etal Determination of the anamorph of Cordyceps sinensis inferred from the analysis of the ribosomal DNA internal transcribed spacers and 5.8S rDNA. Biochemicla Systematics and Ecology .2001, 29 :597～607.
[75] 张云武，陈永久，沈发荣等. 滇西北地区冬虫夏草和阔孢虫草的遗传分化研究. 菌物系统, 1999 ,,18(2):176～183.
[76] 马富英，罗信昌. 分子标记在食用覃菌遗传育种中的应用. 菌物系统,2002 ,21(1):147～151.
[77] 郭春沅. RFLP，RAPD技术在食用菌研究中的应用. 中国食用菌, 2000,18(5):3～4.