表皮生长因子-透明质酸合膜对皮肤切口愈合的影响
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摘要
目的：研制表皮生长因子-透明质酸复合膜，通过动物实验观察其对皮肤切口愈合的影响，探讨表皮生长因子-透明质酸复合膜抑制瘢痕的作用机制，为临床应用提供实验依据。
方法：1. 表皮生长因子膜、透明质酸膜及表皮生长因子-透明质酸复合膜的制备：透明质酸、表皮生长因子、聚乙烯醇配制前以分析天平称量。在超净台内，先用无菌生理盐水配制聚乙烯醇溶液，待完全溶解后，再分别放入表皮生长因子、透明质酸、表皮生长因子和透明质酸，用玻璃棒搅拌配制成均匀的凝胶，然后将凝胶平铺于玻璃板上，置低温干燥箱干燥后，制备成表皮生长因子膜，透明质酸膜，表皮生长因子-透明质酸复合膜，再用同样的方法制成聚乙烯醇膜，在超净台内切割成长5.5cm、宽1.0cm的膜。2. 72只SD雄性大鼠，随机分成四组，全麻下于背部脊柱两侧旁1cm处，平行脊柱分别做长约5cm的切口，切开皮肤、皮下组织，深达肌层，3～0丝线缝合。将表皮生长因子-透明质酸复合膜，表皮生长因子膜，透明质酸膜和聚乙烯醇膜（对照）无菌生理盐水浸湿后分别贴于四组动物的伤口，外用无菌纱布包扎。每日更换外敷膜1次，至术后14天。分别于术
后3、5、7、9、14、21天每组处死3只动物，留取标本，做HE染色，masson染色，EGF、HA免疫组化染色及PCIII含量测定。
结果：1.大体观察：术后3日，聚乙烯醇膜聚乙烯醇膜对照组，部分伤口有血迹，结痂，不易清洁，创周红肿；EGF-HA复合膜治疗组，伤口清洁，渗液较少，部分伤口有少许结痂，炎症反应轻，创周无明显红肿；EGF膜治疗组，表皮愈合倾向明显；HA膜治疗组类似于EGF-HA复合膜治疗组。术后5日，聚乙烯醇膜聚乙烯醇膜对照组，伤口大部分结痂，创周稍红肿，缝线处反应较重；EGF-HA复合膜治疗组表皮层愈合，无红肿，部分伤口有轻微缝线反应；EGF膜治疗组和HA膜治疗组类似于EGF-HA复合膜治疗组。术后7日，聚乙烯醇膜聚乙烯醇膜对照组，部分伤口处仍有血痂，部分缝线脱落，部分伤口仍有较重缝线反应；EGF-HA复合膜治疗组伤口愈合良好，表面清洁干净，部分缝线脱落；EGF膜治疗组和HA膜治疗组类似于EGF-HA复合膜治疗组。术后9、14、21天，聚乙烯醇膜聚乙烯醇膜对照组，伤口愈合良好，可见到明显的愈合线；EGF-HA复合膜治疗组伤口愈合良好，无明显的愈合线；EGF膜治疗组和HA膜治疗组类似于EGF-HA复合膜治疗组。2.HE染色观察：术后3天，聚乙烯醇膜对照组，表面见血凝块和炎性渗出物，表皮不连续，真皮切口未愈，裂隙较大，切口两侧可见成纤维细胞和炎细胞浸润；复合膜组，表皮层愈合，向真皮层轻微凹陷，棘细胞层增生，细胞
层次清楚，真皮层部分愈合，成纤维细胞较多；EGF膜治疗组，表皮层愈合，棘细胞层增生，真皮层少部分愈合，大量成纤维细胞，少量炎细胞浸润；HA膜治疗组，表皮未完全愈合，真皮愈合优于EGF膜治疗组和聚乙烯醇膜对照组，次于复合膜组。术后5天，聚乙烯醇膜对照组，表皮层愈合，角化层形成，可见角质颗粒，棘细胞层增生明显，真皮少部分愈合，仍可见裂隙，裂隙上可见增生的成纤维细胞，炎细胞浸润；复合膜组，表皮愈合，角化程度较聚乙烯醇膜对照组轻，角质颗粒少，真皮层基本愈合，可见较多增生的成纤维细胞；EGF膜治疗组，表皮愈合，较平整，真皮未完全愈合，大量成纤维细胞和炎细胞浸润；HA膜治疗组，表皮层愈合，真皮愈合优于EGF膜治疗组和聚乙烯醇膜对照组，次于复合膜组，可见较多成纤维细胞。术后7天，四组表皮层均愈合，聚乙烯醇膜对照组，真皮未完全愈合，真皮成纤维细胞胞体粗大，成层状聚集排列，与愈合线垂直，有炎细胞浸润；复合膜组，真皮层愈合，成纤维细胞胞体较小，胞核细长，疏松排列，较规则；EGF膜治疗组，接近复合膜组，优于聚乙烯醇膜对照组；HA膜治疗组，真皮层未完全愈合，其它情况同复合膜组。术后9天，聚乙烯醇膜对照组，表皮有凹陷，角化较重，胶原排列有明显的方向性，较粗；复合膜组，表皮平坦，胶原束较小，在真皮浅层处排列接近正常组织；EGF膜治疗组、HA膜治疗组表皮基本平坦，胶原束较小，排列相对疏松。术后14、21天，聚乙烯醇膜对照组角化明显，胶原
排列成束，致密，与切口线垂直；复合膜组、EGF膜治疗组、HA膜治疗组角化不明显，表皮层厚度基本正常、平坦，胶原束较小，排列相对疏松。3.masson染色：术后7天，聚乙烯醇膜对照组，绿色着色带较宽，切口两侧胶原排列相对致密胶原束粗大，与切口垂直；复合膜组，绿色着色带较窄，胶原束纤细，排列相对疏松，部分切口处胶原排列接近正常组织；EGF膜治疗组、HA膜治疗组，绿色着色带宽度介于复合膜组和聚乙烯醇膜对照组之间，新生胶原纤维量较少，胶原束纤细，排列相对疏松。4.HA免疫组化染色观察：复合膜组，3、5、7天表皮上层染色均为强阳性，第9天为阳性，表皮下层染色由阳性转为弱阳性，真皮层由强阳性转为阳性；EGF膜治疗组， 3天时表皮层强阳性，5、7天弱阳性，9天阴性，到第9天时，真皮层染色也由强阳性转为阳性；HA膜治疗组，表皮层染色除3天为强阳性，其它为阳性，第9天，真皮染色也由强阳性转为阳性；聚乙烯醇膜对照组，除7、9天基底层染色阳性外，表皮层均为阴性，3天真皮染?
Objective:To develop the compound group of epidermal growth factor (EGF) and hyaluronic acid (HA),to observe the mechanism and the effect of the compound group on the wound healing of rats.To provides an experimental basis for clinical application.
Methods:1.Preparation of the compound group made from EGF and HA:Under the asepsis conditon,the compound group of EGF and HA was completed.In the same condition ,the other three groups, EGF group ,HA group and polyvinyl alcohol group were completed.2.Seventy-two male SD rats were randomly divided into four groups.Under general anesthesia ,two 5cm cuts were made on two sides,parallel to the spine with the deep from epidermis to the muscle layer.Then the cut was sewn with 3~0 suture. The cuts of four groups were applided respectively with compound group of EGF and HA, EGF group, HA group and polyvinyl alcohol group(control group),and then bound up with sterile gauze.On the 3rd,5th,7th,9th,14th and 21st days after the surgery,3 rats in each group were killed to be
collected to specimens.The expression of EGF,HA in skin was detected with Streptavidin/Peroxidasa(SP) immunohistichemical methods. Under light microscope (LM),the histologic change was observed and the content of PCIII was determined.
Result:1.General observation: After surgery ,in three treatment groups the wound were clean,with little seepage on the surface of the wound,slight inflammation,no obvious red and swollen around the cut,and the healing line was not clear.In the control group ,there were escharosis on the surface of the wound, much more seepage,the wound was hard to clean,red and swollen around the cut and there was an obvious healing line after the wound healing. 2.Observation under LM:After surgery ,compared with cotrol group,in compound group group,there was few inflammatory cell infiltrated on both sides of derma incision;the proliferation of acanthoid cell layer was not obvious;the FBs with a bit small body and slim nucleus spread loosely;quite few new collagen fibers could be seen on both sides of the cut,with comparably small bunches of loosely spread collagen,and they were slight keratinized.EGF group group and HA group group were superior to control group,inferior to group compound group group.3.Distribution of HA in the skin: the upper part of the epidermal and the dermis of compound group group showed HA stain strong positive on the 3rd,5th,7th day,and
turned to positive on the 9th day;the below part of the epidermal turned from positive to weak positive. The epidermal of EGF group group showed HA stain strong positive on the 3rd day,and turned to negative on the 9th day,and the dermis turned from strong positive to positive.HA stain of HA group group was similar to compound group group.The below part of the epidermal of control group showed HA stain positive on the 7th,9th day,showed negative on the 3rd,5th day;the dermis showed HA stain weak positive on the 3rd day,turned to negative on the other days. 4.Distribution of EGF in the skin: the upper part of the epidermal of compound group group showed EGFstain strong positive on the 3rd,5th,7th ,9th day; the below part of the epidermal and fibroblast and hair follicle showed EGFstain positive on the 3rd,5th,7th day,and turned to weak positive on the 9th day.The upper part of the epidermal of EGF group group showed EGFstain strong positive, the below part of the epidermal and fibroblast and hair follicle showed EGFstain positive.The epidermal of HA group group showed EGFstain positive. The epidermal of control group showed EGFstain positive on the 3rd day, the hair follicle weak positive; fibroblast and hair follicle showed EGFstain positive on 5th,7th and 9th day.5.PCIII content: the content of compound group group was significant higher than control group on all point time (P<0.05);the content of
PCIII in EGF group group and HA group group was obviously higher than control group on all days except the 21st day(P<0.05);the content of PCIII in compound group group was obviously higher than EGF group grou
方法：1. 表皮生长因子膜、透明质酸膜及表皮生长因子-透明质酸复合膜的制备：透明质酸、表皮生长因子、聚乙烯醇配制前以分析天平称量。在超净台内，先用无菌生理盐水配制聚乙烯醇溶液，待完全溶解后，再分别放入表皮生长因子、透明质酸、表皮生长因子和透明质酸，用玻璃棒搅拌配制成均匀的凝胶，然后将凝胶平铺于玻璃板上，置低温干燥箱干燥后，制备成表皮生长因子膜，透明质酸膜，表皮生长因子-透明质酸复合膜，再用同样的方法制成聚乙烯醇膜，在超净台内切割成长5.5cm、宽1.0cm的膜。2. 72只SD雄性大鼠，随机分成四组，全麻下于背部脊柱两侧旁1cm处，平行脊柱分别做长约5cm的切口，切开皮肤、皮下组织，深达肌层，3～0丝线缝合。将表皮生长因子-透明质酸复合膜，表皮生长因子膜，透明质酸膜和聚乙烯醇膜（对照）无菌生理盐水浸湿后分别贴于四组动物的伤口，外用无菌纱布包扎。每日更换外敷膜1次，至术后14天。分别于术
后3、5、7、9、14、21天每组处死3只动物，留取标本，做HE染色，masson染色，EGF、HA免疫组化染色及PCIII含量测定。
结果：1.大体观察：术后3日，聚乙烯醇膜聚乙烯醇膜对照组，部分伤口有血迹，结痂，不易清洁，创周红肿；EGF-HA复合膜治疗组，伤口清洁，渗液较少，部分伤口有少许结痂，炎症反应轻，创周无明显红肿；EGF膜治疗组，表皮愈合倾向明显；HA膜治疗组类似于EGF-HA复合膜治疗组。术后5日，聚乙烯醇膜聚乙烯醇膜对照组，伤口大部分结痂，创周稍红肿，缝线处反应较重；EGF-HA复合膜治疗组表皮层愈合，无红肿，部分伤口有轻微缝线反应；EGF膜治疗组和HA膜治疗组类似于EGF-HA复合膜治疗组。术后7日，聚乙烯醇膜聚乙烯醇膜对照组，部分伤口处仍有血痂，部分缝线脱落，部分伤口仍有较重缝线反应；EGF-HA复合膜治疗组伤口愈合良好，表面清洁干净，部分缝线脱落；EGF膜治疗组和HA膜治疗组类似于EGF-HA复合膜治疗组。术后9、14、21天，聚乙烯醇膜聚乙烯醇膜对照组，伤口愈合良好，可见到明显的愈合线；EGF-HA复合膜治疗组伤口愈合良好，无明显的愈合线；EGF膜治疗组和HA膜治疗组类似于EGF-HA复合膜治疗组。2.HE染色观察：术后3天，聚乙烯醇膜对照组，表面见血凝块和炎性渗出物，表皮不连续，真皮切口未愈，裂隙较大，切口两侧可见成纤维细胞和炎细胞浸润；复合膜组，表皮层愈合，向真皮层轻微凹陷，棘细胞层增生，细胞
层次清楚，真皮层部分愈合，成纤维细胞较多；EGF膜治疗组，表皮层愈合，棘细胞层增生，真皮层少部分愈合，大量成纤维细胞，少量炎细胞浸润；HA膜治疗组，表皮未完全愈合，真皮愈合优于EGF膜治疗组和聚乙烯醇膜对照组，次于复合膜组。术后5天，聚乙烯醇膜对照组，表皮层愈合，角化层形成，可见角质颗粒，棘细胞层增生明显，真皮少部分愈合，仍可见裂隙，裂隙上可见增生的成纤维细胞，炎细胞浸润；复合膜组，表皮愈合，角化程度较聚乙烯醇膜对照组轻，角质颗粒少，真皮层基本愈合，可见较多增生的成纤维细胞；EGF膜治疗组，表皮愈合，较平整，真皮未完全愈合，大量成纤维细胞和炎细胞浸润；HA膜治疗组，表皮层愈合，真皮愈合优于EGF膜治疗组和聚乙烯醇膜对照组，次于复合膜组，可见较多成纤维细胞。术后7天，四组表皮层均愈合，聚乙烯醇膜对照组，真皮未完全愈合，真皮成纤维细胞胞体粗大，成层状聚集排列，与愈合线垂直，有炎细胞浸润；复合膜组，真皮层愈合，成纤维细胞胞体较小，胞核细长，疏松排列，较规则；EGF膜治疗组，接近复合膜组，优于聚乙烯醇膜对照组；HA膜治疗组，真皮层未完全愈合，其它情况同复合膜组。术后9天，聚乙烯醇膜对照组，表皮有凹陷，角化较重，胶原排列有明显的方向性，较粗；复合膜组，表皮平坦，胶原束较小，在真皮浅层处排列接近正常组织；EGF膜治疗组、HA膜治疗组表皮基本平坦，胶原束较小，排列相对疏松。术后14、21天，聚乙烯醇膜对照组角化明显，胶原
排列成束，致密，与切口线垂直；复合膜组、EGF膜治疗组、HA膜治疗组角化不明显，表皮层厚度基本正常、平坦，胶原束较小，排列相对疏松。3.masson染色：术后7天，聚乙烯醇膜对照组，绿色着色带较宽，切口两侧胶原排列相对致密胶原束粗大，与切口垂直；复合膜组，绿色着色带较窄，胶原束纤细，排列相对疏松，部分切口处胶原排列接近正常组织；EGF膜治疗组、HA膜治疗组，绿色着色带宽度介于复合膜组和聚乙烯醇膜对照组之间，新生胶原纤维量较少，胶原束纤细，排列相对疏松。4.HA免疫组化染色观察：复合膜组，3、5、7天表皮上层染色均为强阳性，第9天为阳性，表皮下层染色由阳性转为弱阳性，真皮层由强阳性转为阳性；EGF膜治疗组， 3天时表皮层强阳性，5、7天弱阳性，9天阴性，到第9天时，真皮层染色也由强阳性转为阳性；HA膜治疗组，表皮层染色除3天为强阳性，其它为阳性，第9天，真皮染色也由强阳性转为阳性；聚乙烯醇膜对照组，除7、9天基底层染色阳性外，表皮层均为阴性，3天真皮染?
Objective:To develop the compound group of epidermal growth factor (EGF) and hyaluronic acid (HA),to observe the mechanism and the effect of the compound group on the wound healing of rats.To provides an experimental basis for clinical application.
Methods:1.Preparation of the compound group made from EGF and HA:Under the asepsis conditon,the compound group of EGF and HA was completed.In the same condition ,the other three groups, EGF group ,HA group and polyvinyl alcohol group were completed.2.Seventy-two male SD rats were randomly divided into four groups.Under general anesthesia ,two 5cm cuts were made on two sides,parallel to the spine with the deep from epidermis to the muscle layer.Then the cut was sewn with 3~0 suture. The cuts of four groups were applided respectively with compound group of EGF and HA, EGF group, HA group and polyvinyl alcohol group(control group),and then bound up with sterile gauze.On the 3rd,5th,7th,9th,14th and 21st days after the surgery,3 rats in each group were killed to be
collected to specimens.The expression of EGF,HA in skin was detected with Streptavidin/Peroxidasa(SP) immunohistichemical methods. Under light microscope (LM),the histologic change was observed and the content of PCIII was determined.
Result:1.General observation: After surgery ,in three treatment groups the wound were clean,with little seepage on the surface of the wound,slight inflammation,no obvious red and swollen around the cut,and the healing line was not clear.In the control group ,there were escharosis on the surface of the wound, much more seepage,the wound was hard to clean,red and swollen around the cut and there was an obvious healing line after the wound healing. 2.Observation under LM:After surgery ,compared with cotrol group,in compound group group,there was few inflammatory cell infiltrated on both sides of derma incision;the proliferation of acanthoid cell layer was not obvious;the FBs with a bit small body and slim nucleus spread loosely;quite few new collagen fibers could be seen on both sides of the cut,with comparably small bunches of loosely spread collagen,and they were slight keratinized.EGF group group and HA group group were superior to control group,inferior to group compound group group.3.Distribution of HA in the skin: the upper part of the epidermal and the dermis of compound group group showed HA stain strong positive on the 3rd,5th,7th day,and
turned to positive on the 9th day;the below part of the epidermal turned from positive to weak positive. The epidermal of EGF group group showed HA stain strong positive on the 3rd day,and turned to negative on the 9th day,and the dermis turned from strong positive to positive.HA stain of HA group group was similar to compound group group.The below part of the epidermal of control group showed HA stain positive on the 7th,9th day,showed negative on the 3rd,5th day;the dermis showed HA stain weak positive on the 3rd day,turned to negative on the other days. 4.Distribution of EGF in the skin: the upper part of the epidermal of compound group group showed EGFstain strong positive on the 3rd,5th,7th ,9th day; the below part of the epidermal and fibroblast and hair follicle showed EGFstain positive on the 3rd,5th,7th day,and turned to weak positive on the 9th day.The upper part of the epidermal of EGF group group showed EGFstain strong positive, the below part of the epidermal and fibroblast and hair follicle showed EGFstain positive.The epidermal of HA group group showed EGFstain positive. The epidermal of control group showed EGFstain positive on the 3rd day, the hair follicle weak positive; fibroblast and hair follicle showed EGFstain positive on 5th,7th and 9th day.5.PCIII content: the content of compound group group was significant higher than control group on all point time (P<0.05);the content of
PCIII in EGF group group and HA group group was obviously higher than control group on all days except the 21st day(P<0.05);the content of PCIII in compound group group was obviously higher than EGF group grou
引文
综述
表皮生长因子对伤口愈合的影响
表皮生长因子（Epidermal Growth Factor,EGF）于1962年由Cohen[]在小鼠的颌下腺中分离出来并纯化成功，并因其能刺激表皮的生长和角化而得名。提纯的EGF注入新生小鼠有促使其早数日开眼、长牙的作用。在随后的大量研究中发现EGF具有广泛的生物学功能，尤其对伤口愈合具有促进作用[]。伤口愈合的过程分为三个相互区别而又联系的阶段：炎症反应期，肉芽组织形成期和新生组织改建期[]。人们发现在伤口愈合的不同阶段均有EGF的参与，并最终促进伤口愈合[,,]。本文就表皮生长因子的结构、受体信号传导机制及其在伤口愈合中的作用等方面作一综述，为EGF在伤口愈合中的临床应用提供理论参考。
EGF的结构、分布及分泌调节
EGF是由53个氨基酸残基构成的单链多肽，不含丙氨酸、苯丙氨酸和赖氨酸，分子量为6kD左右，对酸和热都很稳定，等电点(PI)为4.6，含3个链内二硫键。二硫键对维持EGF的蛋白质空间构象很重要，而空间构象又与其活性密切相关，当链内二硫键被破坏后，EGF的活性就丧失[]。
EGF主要存在与颌下腺，成人十二指肠和肾脏中亦表达，尿和乳汁中也可检测到，但胎儿成长期时很难检出[]。
对大鼠皮肤免疫染色发现，EGF在表皮基底层染色明显强于其它各层，毛囊上皮在毛球部染色为阳性，在中部为弱阳性或阴性，其外方的基膜为阳性染色，成纤维细胞染色阳性，仅部分内皮细胞阳性，骨骼肌细胞胞质的边缘部呈弱阳性[]。正常胎儿表皮全层和毛囊、皮脂腺及汗腺细胞可见EGF的阳性表达，创伤后的胎儿皮肤中EGF表达未见明显变化；正常成人皮肤可见表皮基底层中度阳性表达，毛囊、汗腺细胞也可见到轻度表达，成人皮肤创伤后表达有所减弱[]。EGF在胎儿和成人皮肤创面愈合过程中的差异表达可能是胎儿无瘢痕愈合的重要原因之一。放免法测定孕兔、成年兔伤口愈合模型EGF的表达发现，胎儿伤口中EGF术后3d明显升高，并维持至术后7d；孕兔及成年兔仅在术后3d升高，术后7d降到接近正常水平，提示胎兔皮肤伤口中特有的细胞因子水平是胎儿无瘢痕愈合的重要因素，临床可考虑应用外源性EGF来提高成兔伤口中EGF的水平，从而促进伤口愈合[]。
EFG来自唾液腺、肾上腺上皮细胞，创伤后EGF主要由血小板、角化细胞和激活的巨噬细胞合成 []，EGF与受体结合后以自分泌或旁分泌的方式作用于创面[]。激素可刺激EGF的合成和贮存，但不影响其释放，α-肾上腺素能调节EGF的释放[]。
EGF的受体信号转导机制及其分布
EGF受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)是位于细胞表面多功能的跨膜单链糖蛋白，由1186个氨基酸组成。EGFR结构分三个功能区域：由621个氨基酸残
基构成的伸向膜外与EGF识别并结合的氨基端区域，位于细胞膜中间含23个疏水氨基酸的跨膜区，以及含542个氨基酸残基的具有酪氨酸激酶活性和自磷酸化位点的位于质膜内侧的羧基端区域[]。
当EGF与EGFR的氨基端区域结合后，可引起后者构象发生变化。EGFR羧基端区域末端的三个酪氨酸残基(Tyr)自身磷酸化位点发生磷酸化，结果导致受体酪氨酸激酶活化，使细胞内三磷酸肌醇(IP3)和二酰基甘油增多，作为第二信使引起细胞内游离Ca2+增多，激活磷酸蛋白激酶C和磷酸蛋白激酶A，使细胞增殖和功能发生改变[]。体外试验证明，诱导EGFR自身磷酸化的位置是在其羧基端1068、148、1173和氨基端一个位点的四个Tyr残基，在体内EGFR自身磷酸化位点主要发生在1173的Tyr残基，而受体其它三个Tyr残基磷酸化程度较体外为少。
EGF受体几乎所有细胞都有表达(皮肤角化细胞、血管内皮细胞、表皮细胞)但以表皮细胞最为丰富，高水平表达主要是表皮的基底细胞层汗腺、毛囊，愈向表皮层愈少[15]。研究深II度烧伤创面愈合过程中EGF/EGFR的表达发现伤后5d内创面局部EGF表达量均明显低于正常聚乙烯醇膜对照组，至伤后7d增加到对照水平，并继续增加于伤后14d达到最高值，后又降低，伤后1d EGFR表达量显著低于正常聚乙烯醇膜对照组，伤后3d-5d逐渐增加，伤后7d其表达量即开始明显高于对照直至伤后21d，其中伤后10d达到最高值，与EGF相比，其出现表达增强及高峰值的时间均较早，且持续时间长[10]，说明在伤后
早期EGFR对促进EGF的表达具有一定的调控作用，此时配合应用外源性EGF也许有助于启动创面修复，促进创面愈合。
EGF与炎症反应
炎症反应是创伤愈合中必不可少的一步，抑制炎症反应将延迟或抑制伤口愈合，创伤发生后，首先是血小板向伤部聚集，在创伤部位发生血液凝固，凝血过程中血小板颗粒释放EGF等生长因子[12]，其后，激活的巨噬细胞继而分泌巨噬细胞源性生长因子等，它们作为信使再介入和调节各种细胞效应，导致连锁放大作用并使伤口愈合过程有秩序地完成。EGF具有趋化性迁移作用，可以促进修复细胞（表皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞）和炎症细胞向伤口部位移动、分裂增生[]，炎症细胞到达伤部后发挥吞噬异物、溶解、消除坏死细胞组织的作用，并释放少量的生长因子，它们趋化组织修复细胞继续向伤部聚集，为组织再生和修复奠定基础。EGF作用的发挥，与创面的感染程度关系密切，它本身不具有抗感染作用，研究发现创面组织炎症浸润，组织坏死可致局部组织EGF的释放减少，烧伤创面削痂后创面组织释放EGF水平较未手术创面明显增高，另一方面，在创面愈合早期其创面表层的坏死组织成为分泌物紧覆其上，为局部EGF的应用造成困难，使EGF无法穿透该层组织而作用到皮肤附件的上皮细胞，创面感染程度是影响EGF作用的重要因素[]。炎症反应作为创伤愈合的重要过程，既受EGF的影响，同时也影响EGF，提示临床使用时，应尽早去除创面表层坏死组织
再行EGF治疗。
EGF与再上皮化
表皮受损伤后，再上皮化是一个重要的过程，包括角朊细胞的迁移、增殖和分化三个阶段。表皮受损后，缺损处周围表皮断端的基底细胞首先开始向创面迁移，当皮肤损伤较深时，迁移的表皮细胞还可来自于残存的毛囊，当迁移的表皮细胞彼此相遇时，由于接触抑制，细胞的迁移和分裂活动停止，此时基底细胞开始进一步分化，最终形成表皮的各个层次。EGF对角朊细胞的增生，迁移和分化具有重要调节作用，它是一种促间充质细胞和表皮细胞进行有丝分裂的丝裂原，可以促进哺乳类动物进行有丝分裂和影响其某些分化过程[,]。研究发现运用EGF致猪深II度烧伤创面，创面愈合中细胞DNA周期中的G1期比例下降，S期及G2＋M期比例增多，上皮愈合速度加快[]。在应用rhEGF治疗皮肤溃疡创面时发现，在表皮基底与角质层细胞之间的棘细胞与颗粒细胞中出现了罕见的干细胞团，在组织学上与基底干细胞没有直接联系，为一独立的岛状结构，与基底层的表皮干细胞属同一类型，可推测EGF可能是诱导细胞逆分化的重要调节因子，干细胞岛现象的发现，表明在rhEGF治疗的创面，表皮的再生过程并不仅仅是在基底层一个平面展开的，而是在基底层、干细胞岛周围多个平面同时展开，由于干细胞数量增多，在同一时间修复发生的平面和角度加大，因此在微量表皮生长因子作用下短期内便产生出显著的修复效应[]。EGF促进了创面的愈合。
EGF与血管形成
除表皮再生外，真皮或皮下组织损伤后的修复必须通过肉芽组织形成的方式进行，肉芽组织中含有丰富的毛细血管，可为组织修复提供氧和必要的营养物质。组织损伤后，邻近创面的血管开始了毛细胞管形成过程，内皮细胞分裂增生、趋化、向无血管或少血管区迁移，逐渐形成毛细血管芽，条索状的毛细血管芽延伸并融合成网，进而管道化并有血液流入。EGF可以激活血管内皮细胞，促进其移动，增加细胞间的相互接触[]，在活体中，它被认为是最重要的刺激血管生成创伤愈合因子，是新生血管生长的有效刺激物[]。Schreiber AB等[]认为， EGF在离体或在体情况下，确有促进血管生成的作用，EGF的连续运用，可以明显增加肉芽组织中血流量[]。
EGF与成纤维细胞
肉芽组织中，除大量新形成的毛细血管外，还存在丰富的成纤维细胞，成纤维细胞是主要修复细胞，Lekic等[]认为，它是创伤修复的工程师、建筑者和管理员，它与细胞外基质、伤口收缩、胶原的更新和瘢痕的形成有着密切的关系。成纤维细胞的来源有三：一是邻近组织中未分化的间充质细胞分化为成纤维细胞并迁移而来；二是邻近组织中的成纤维细胞迁移而来；三是成纤维细胞分裂增生，EGF参与成纤维细胞的三个途径，研究表明，EGF可促进间充质细胞进行有丝分裂，分化为成纤维细胞[,]可促进创伤愈合过程中真皮成纤维细胞的移行[,]，EGF促进成纤维细胞的增殖。细胞正常的分裂、增殖、分化与
衰老维持着机体自身的稳定，细胞周期的异常会导致这一系列过程的紊乱，EGF对DNA代谢的调节是通过影响细胞周期实现的，主要受到三类因子的调控，即细胞周期蛋白（cyclins）、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDKS)和细胞周期蛋白酶的抑制蛋白(CKIS)，其中细胞周期蛋白是调节亚基，CDKS是催化亚基，在调控细胞周期的进程中，常暂时结合形成复合物而发挥作用，CKIS是近年来刚分离得到的一类很重要的细胞周期的负性调控蛋白，这些蛋白在体外通过与CDKS,Cyclins或cyclin-cdks复合物结合达到抑制CDK催化外源性底物的活性。[,]周期蛋白CyclinD1在细胞G1期进化过程中控制着G1期的时间，与催化亚基CDK4(或CDK6)合成复合物构成全酶而发挥其调控作用，促使细胞越过限制点，完成G1期-S期时相的转换。CyclinD1过度表达可导致细胞G1期缩短，提前进入S期，细胞周期缩短，增殖加强[,]。将EGF作用于真皮成纤维细胞，通过免疫组化及流式细胞仪检测表明，CyclinD1及CDK4表达增强，G1期细胞变小，可推测EGF作用于真皮成纤维细胞后，促使细胞中CyclinD1，及其催化亚基CDK4的表达增强，从而使细胞周期缩短，增殖能力增强[]，EGF作为有丝分裂原能直接促进肉芽组织中成纤维细胞，血管内皮细胞平滑肌细胞等等增殖与分化，从而加快肉芽组织的生长速度，肉芽组织的快速生长也为表皮细胞的及早覆盖提供了可能。
EGF与细胞外基质
细胞和细胞外基质(ECM)构成了组织，细胞外基质在
创伤愈合过程中，发挥重要作用，ECM由四类大分子物质(1)胶原(2)弹性蛋白(3)非胶原性蛋白(4)蛋白聚糖和氨基聚糖组成。ECM能影响细胞的形状，控制细胞的迁移、增生、分化和代谢。EGF与胶原和透明质酸关系密切。
7.1 EGF对胶原的影响
胶原是细胞外基质的主要成分，皮肤的胶原成分，以I、III型胶原含量较高。正常皮肤中，I型胶原与III型胶原同时存在，两者比例约为3.5：1,胎儿皮肤胶原含量低于成年皮肤组织，并以III型胶原为主，随胎龄越长，I型胶原增多，I/III型胶原的比例逐渐增高[]，其胶原纤维较成年为细 [,]。在伤口愈合的早期，III型胶原形成一种支架，随后聚集的III型胶原被快速聚集的I型胶原所覆盖，I型胶原能提供机械强度[]。在伤口愈合过程中，早期III型胶原具有重要的作用如建立初期的伤口框架，引导炎症细胞和成纤维细胞进入伤口，为伤口血供的重建提供基质，它也调节胶原直径的大小及胶原的排列。创伤后胎儿伤口胶原合成迅速增加，其胶原的沉积较成人更早、更迅速[]。目前普遍认为，无瘢痕愈合的关键并非胶原合成减少，而是胶原呈正常网状排列[]。EGF对瘢痕成纤维细胞起作用抑制DNA的合成刺激胶原增生，使胶原的类型发生改变[,]。将外源性rhEGF用于放射复合创伤伤口愈合中，7天时发现rhEGF用药创面肉芽组织层较对照创面明显增厚，III型胶原免疫组化染色阳性程度较强，I、III型胶原的合成和分泌也较对照创面明显增多；伤后14天，rhEGF用药创面内纤维组织较为‘成熟’。说
明外源性rhEGF使放射复合伤口愈合过程中胶原合成的时机提前了。rhEGF用药创面I、III型胶原mDNA含量的增加是与肉芽组织含量的增加基本成比例的，胶原含量的增加促进肉芽组织的成熟速度，提高愈合质量[]。Latto M[]等认为EGF增加肉芽组织中胶原含量的作用是通过刺激成纤维细胞的分裂，使成纤维细胞数目增加实现的，而不是直接刺激成纤维细胞前胶原基因表达的结果。
7.2 EGF与透明质酸
透明质酸(HA)是细胞外基质的重要成分之一，胚胎伤口中的HA具有出现早、含量高和维持时间长等特点，HA参与了胚胎创伤修复内环境的构成，在伤口基质中高浓度的HA是胎儿无瘢痕愈合的重要特征之一[]。高浓度的HA可使ECM随形性较好，流动性大，有利于成纤维细胞增殖、游走和保持逆向分化[]，]在培养基中加入外源性HA[]，可提高成纤维细胞产生的III型胶原的沉积，而I型胶原和III型胶原的比例决定了胶原纤维排列的粗细，当该比例较低时，胶原纤维较细并且排列比较规则，形成的瘢痕也较小。EGF对人成纤维细胞合成HA有明显的刺激作用，研究表明，EGF可诱导鼠上皮角化细胞层周围形成HA外衣，并将HA的合成提高3-5倍[]。EGF增加核周小泡中的HA，同时增加其内吞作用。HA在受EGF刺激后拉长并移动的细胞中含量丰富，这与伤口愈合过程中检测到的相同，EGF可同时增加细胞周和细胞内HA合成，可以在mRNA和蛋白水平上调成纤维细胞表面CD44分子的粘连性（CD44是一种广泛存在的多形的糖蛋白，
是HA的主要的细胞表面受体），因而增加了细胞对HA的粘附[]，提示将HA与EGF联合运用可作为促进创伤愈合的一个途径。
EGF与伤口收缩
皮肤损伤后数日，伤口边缘的整层皮肤向伤口中心移动，伤口逐渐缩小，伤口收缩的意义在于缩小创面，伤口肉芽组织产生的收缩力来自于含有收缩蛋白的肌成纤维细胞（MFB），肌成纤维细胞是成纤维细胞转化而来，需要有a-平滑肌肌动蛋白(a-SMA)的表达，MFB在正常瘢痕组织中逐渐消失，而在增生性瘢痕和纤维化疾病中持续存在，MFB是通过凋亡而死亡、消失[]。尽管伤口收缩是伤口愈合过程中必不可少的过程，但伤口过度的收缩将增加瘢痕的形成，伤口收缩有许多细胞因子的参与。TGF-β诱导成纤维细胞转化成肌成纤维细胞，TGF-β1引起伤口过度收缩，诱导动物和人瘢痕的形成已被人们所接受, Park JS []等模仿伤口制成成纤维细胞胶原网架模型（FPCL），研究TGF-β1及EGF作用时发现，TGF-β1引起FPCL的明显收缩，而EGF本身不影响FPCL的正常收缩，还可抑制TGF-β1的分泌和活性，抑制自身固有的TGF-β1的产生，从而对抗TGF-β1引起的FPCL的过度收缩，减少瘢痕的形成，作者还发现EGF能够显著抑制瘢痕成纤维细胞a-SM-actinm RNA的水平，改变与凋亡有关的bax水平的表达，提示，可将EGF 用于临床，以对抗TGF-β1引起的伤口过度收缩，减少瘢痕的形成。
EGF 与组织重塑
肉芽组织形成和再上皮化后，创伤愈合的过程并未停止，进入组织重塑期，胶原的更新是影响伤口的重建及瘢痕形成的重要因素，该过程主要依赖于胶原酶的作用，而胶原酶主要是由成纤维细胞产生的。EGF可以调节成纤维细胞胶原酶的表达[]，结缔组织形成时，新的胶原不断合成，此时胶原酶不仅继续分解残存的胶原，也分解新合成的胶原，胶原纤维的沉积和分解形成动态平衡，使胶原变得稳固，并完善伤口的结构。伤口收缩和重建时，胶原酶活性逐渐降低，创面胶原沉积，创伤得以修复[]，应用EGF治疗深II度烧伤创面的远期临床疗效观察发现，经rhEGF治疗的深II度烧伤创面愈合后1、4年时，其SI(瘢痕指标)均明显小于聚乙烯醇膜对照组创面，提示早起应用rhEGF可减轻创面后期的瘢痕形成，且远期疗效较好，EGF抑止皮肤内源性TGF-β1的合成，进而对后者所诱导的胶原过度合成和收缩起抑制作用[]。因此，EGF可能对瘢痕形成有直接抑制作用。
EGF在伤口愈合中的临床应用
EGF自提纯以来，大量的研究证明其对伤口的愈合具有促进作用并能抑制瘢痕的形成，80年代以来创伤领域以EGF的发现及广泛的生物学活性研究成果为契机，通过基因重组技术已成功地生产出高纯度的活性和结构与天然产物高度一致的重组人表皮生长因子(rhEGF)，为EGF在创伤等各个领域的大规模应用提供了现实的可能性。八十年代末，Brown等将磺胺嘧啶银软膏和含有EGF的软膏按随机，双盲法用于12位患者的2个皮肤移植供
皮位点，每日进行拍照，测量伤口愈合情况，发现所有12位患者运用EGF的伤口上皮再生均较聚乙烯醇膜对照组加快。EGF治疗组有25-50%愈合速度提高1天，提高1.5天的占75%-100%，可以说EGF加速皮浅II度伤口的愈合[]。运用rhEGF作用于浅II度、深II度烧伤创面、慢性溃疡创面和中原供皮区创面，结果表明EGF对各种创面的愈合都有促进作用[]，经表皮生长因子治疗而愈的溃疡创面皮肤免疫组化发现创面表皮中出现干细胞岛表皮的再生从多个平面同时展开，短期内产生出显著的修复效果。[ ]EGF对剖宫产妇感染切口愈合也有促进作用。外用重组人表皮生长因子对健康人体和烧伤患者不良反应试验表明[]在受试患者中，创面愈合速度较传统治疗方法有加快的趋势，未见组织过度增生或瘢痕肥大现象，皮肤刺激反应极轻微，与传统外用药物相比，不良反应较少，无论是健康志愿者或是志愿受试者对rhEGF均有较好的耐受性，不同剂量组的志愿受试患者连续用药15d，血清检查结果表明，rhEGF无免疫反应，健康受试者及受试患者用药前后肝、肾功能及血、尿常规均无明显变化，目前为止，还没有证据表明应用rhEGF后引起瘢痕和癌变以及肝、肾功能障碍，但临床应用仍存在以下问题：（1）EGF本身不具备康感染能力，只有在伤口感染控制，组织渗出明显减少，再应用rhEGF方能取得较明显的疗效。（2）EGF半衰期很短，且很快被伤口渗液中的蛋白酶降解，使疗效受到很大影响，因而需要多次甚至持续给药，这就要研究适当的药物投递系统。（3）给药的时机、剂量尚待进
一步研究。
展望
伤口愈合一直是烧、创伤领域研究的焦点，过去往往采用抗感染敷料覆盖等措施等待创面自然愈合，周期较长，易感染，影响治疗效果。EGF的发现及生产，为伤口愈合提供了新的治疗途径，EGF已从基础和临床研究上证实具有加快伤口愈合，提高愈合质量的作用，局部给药途径最为快捷，简便有效，从水剂、膏剂人们研制了各种给药方法，转基因成纤维[]细胞向创面持续投递新型分泌型表皮生长因子，可刺激表皮细胞和皮肤成纤维细胞分裂，并加强其他生长因子的合成和作用，从而显著地促进表皮再生，转基因细胞释放的EGF局限于创面，未扩散至全身，既在创面发挥作用，又无全身用药可能造成的副作用，达到了局部使用EGF的目的，转基因转染技术的成熟，可望将伤口愈合的治疗提高到一个新的水平。
参考文献
致 谢
本课题的设计、完成以及论文的撰写、修改是在导师董福生教授的严格要求和悉心指导下进行的。他对待人生的态度和原则、严谨的科学态度、忘我的工作精神，科学思考问题的方法，让我终身受益无穷。在论文完成之际，谨向尊敬的导师致以最诚挚的谢意！
衷心感谢河北医科大学口腔医学院病理科王洁教授、李荷香副教授、王旭老师、顾洪涛老师在实验过程中给予的大力指导和帮助！
衷心感谢河北医科大学第二医院同位素科乔丽敏副教授在放射免疫技术方面给予的指导和帮助！
衷心感谢河北医科大学组胚教研室赵春芳老师在免疫组化技术方面给予的指导和帮助！
衷心感谢河北医科大学口腔医院任贵云老师在实验过程中给予的大力支持、指导和帮助！
衷心感谢河北医科大学口腔医院口腔颌面外科、放射科全体老师及医护人员在实验过程中给予的大力支持和帮助！
衷心感谢我的师兄、师弟、师妹们在实验过程中给予的无私帮助和大力支持！
最后，衷心感谢我的家人对我坚实的支持和帮助！
个人简历
般情况
姓名 赵丽 性别 女 民族 汉
出生日期 1972年12月10日 籍贯 四川省开县
个人经历
1990年9月-1995年7月 河北医科大学口腔医学系 学生
1995年7月-2000年10月 华北石油二部医院口腔科
医师
1997年7月-1998年1月 北京医科大学附属口腔医学院 进修
2000年10月-2001年9月 华北石油二部医院口腔科
主治医师
2001年9月至今 河北医科大学研究生学院 研究生
发表论文
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2 赵丽, 刘淑芹, 华北油田120名医务人员艾滋病知识水平调查, 中国特色医药杂志, 2000,1(5):12
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