MPP穿膜结构域的结构模拟、特征分析及MPP介导的转基因载体体系的构建和转导研究
摘要
经典细胞学理论认为：生物大分子(蛋白质，核酸)不能直接通过自由扩散的方式进入细胞，被细胞摄取。然而，近7年来，已经有实验证明：在一些穿膜多肽介导下的蛋白质和核酸以一种非受体依赖方式、非经典内吞方式直接穿过细胞膜进入细胞。
1988年，Frankel等发现免疫缺陷病毒(HIV)中有一种转录调节蛋白TAT，它能进入细胞核，激活HIV-1的启动子，从而促进HIV的扩增。最初，研究人员的焦点集中在TAT对HIV的启动作用。但是，随后的研究发现，TAT蛋白本身具有一种极其特殊的生物学活性，它可以直接穿过细胞膜、细胞核膜并瞄着于特定基因调控区内。而且介导穿膜的氨基酸序列和调节转录的序列相同。接着Daniele发现Antennspedia基因编码的一类同源蛋白质也能以类似方式穿过细胞膜。2000年，郭勇等发现果蝇的周期调节蛋白Period 1也具有类似的生物学功能，并把这类肽命名为细胞膜穿透肽(membrane penetrating peptide，MPP)。进一步，他根据穿膜肽的序列特性，从哺乳动物的基因数据库中调出11条基因，发现其中4条基因编码的蛋白质，同样具有穿膜活性。这类穿膜肽的穿膜机制目前还没有明确，MPP结构与功能关系的研究、MPP应用于基因转移体系的基础理论研究已经成了该领域的重要研究内容。
本文从MPP结构与功能入手，对MPP作了如下几方面的实验研究工作，通过多肽模拟体系，以PER1及其12个突变体为对象，预测了MPP空间结构和分析了MPP结构特征、结构中电荷分布特征、疏水特征及膜界能量学变化等物理学特性，从结构与能量学的角度为解释MPP穿膜机制提供了重要的数据。另外，从生物大分子治疗学角度，应用分子生物学技术构建及表达了MPP介导的特异性和非特异性两种转基因载体体系，进一步研究该载体体系的自身穿膜特性、穿膜介导特性、组织特异性穿膜特性及穿血脑
山西医科人学2003届博士学位论文
中文摘要
屏障介导特性等实验。为M即的应用提供基础研究数据。
1.MPP穿膜结构域的结构模拟及物理学特征分析
MPP穿膜区同源序列比较，氨基酸组成分析
MPP是一类一有介导生物人分子穿膜的功能多肤。这类特殊转导蛋白
进入细胞的机制还未阐明清楚，但是一些传导蛋白如:TAT、ANTP、VP22、
Perl等与传导有关的I)J能区一蛋白转导区(Protein transduetion domain，
PTD)己经明确。TAT蛋白的最基本转导单位是由n个氨基酸残基组成，
VPZ:的是267一300氨基酸残基区，ANTP氨基酸残基区是43一58;PERI蛋白
的PTD是 830一845氨基酸残基区。为了阐明M即穿膜的结构基础，我们对
常见的4种M即穿膜区进行了序列同源分析。发现了它们的氨基酸组成特
征，即该区域富含碱性氨基酸。TAT蛋白PTD区11个氨基酸中有8个碱性
氨基酸，其中2个赖氨酸(Lys)，6个精氨酸(Arg)，占73%。vP:2的PTD
区34个氨基酸中有9个碱性氨基酸，全是精氨酸(Arg)，，.‘26%，其中还
有8个丙氨酸(Ala)和5个Pro。ANTP的PTD的16个氨基酸中，有7个
碱性氨基酸，.ll’ 44%，其中4个Lys，3个Arg。PERI的PTD16个氨基酸中
有11个碱性氨基酸，:片69%，其中5个Arg，4个His和2个Lys。
2结构建模、优化及空间结构分析
在对PTD区的氨基酸同源性分析的基础上，我们进行了M即结构域的
结构模拟实验。我们在研究野生型PERI蛋白和其12个突变体的穿膜实验
中发现，这些肤的穿膜能力不同。我们就以13种肤的氨基酸一级结构序列
为对象，对hPERI一M即和其12个突变体均进行了建模、优化。结构优化完
成后，进行评估。利用Profi le一3D对局部二级结构类型、溶剂可及性和被
极性原子遮盖的侧链面积描述的残基所处的环境进行分析。由己知的蛋白
质结构及其序列统计出残基类型对环境类型的倾向性分数，据此来判别一
序列与其结构的兼容性。一个结构的评估分数是它的每一残基与局部环境
的倾向性分数的总和。此13个蛋白质结构Profile一3D评估结果显示，其
结构判别的上卜界为:5.42一12.05，这13个结构经优化后的Profile一3D
值均达到或接近结构判定的上界，说明蛋白质整体折叠是正确的，但是局
部折叠可能存在一些偏差。对13个经优化的结构显示:在13个结构中，
有10个结构(fhm，m3，m4，ms，m6，m7，ms，m12，m13，ml4)在MPP功能片段区
山西医科大学2003届博士学位论文
中文摘要
(12一27)有a一螺旋，同时m3，m4，m6，ms，m12和m14在。一螺旋后存
在一个转角。M即蛋自质做为一种能够与细胞膜相互作用的蛋自质，这种
‘级结构以。一螺旋为土的特性是与一些跨膜蛋白和与膜相互作用的蛋白
相一致的，如G蛋白偶连受体和细菌毒素细胞溶解素等。我们着重比较了
fh。和!m7两个结构，当我们将两个分子利用软件重叠后，显示彼此之间的
上链的RMSD为4.445078A。通过结构比较，我们可以石·到，当Alals取代
Arg18后，蛋白质C端的结构发生明显的变化，。一螺旋变短。在fhm，。-
螺旋由16一21位氨基酸构成，m7的。一螺旋由18一21位氨基酸构成。C端
结构域的在发生突变后，Q一螺旋两端的区域在空间上更为靠近.
1.3表面静电分布及越界自由能计算
用de加hi方程计算表面静电分布，用Insightl工软件观察到的表面电
势分布状况。结果显示，在fhm分子
1988年，Frankel等发现免疫缺陷病毒(HIV)中有一种转录调节蛋白TAT，它能进入细胞核，激活HIV-1的启动子，从而促进HIV的扩增。最初，研究人员的焦点集中在TAT对HIV的启动作用。但是，随后的研究发现，TAT蛋白本身具有一种极其特殊的生物学活性，它可以直接穿过细胞膜、细胞核膜并瞄着于特定基因调控区内。而且介导穿膜的氨基酸序列和调节转录的序列相同。接着Daniele发现Antennspedia基因编码的一类同源蛋白质也能以类似方式穿过细胞膜。2000年，郭勇等发现果蝇的周期调节蛋白Period 1也具有类似的生物学功能，并把这类肽命名为细胞膜穿透肽(membrane penetrating peptide，MPP)。进一步，他根据穿膜肽的序列特性，从哺乳动物的基因数据库中调出11条基因，发现其中4条基因编码的蛋白质，同样具有穿膜活性。这类穿膜肽的穿膜机制目前还没有明确，MPP结构与功能关系的研究、MPP应用于基因转移体系的基础理论研究已经成了该领域的重要研究内容。
本文从MPP结构与功能入手，对MPP作了如下几方面的实验研究工作，通过多肽模拟体系，以PER1及其12个突变体为对象，预测了MPP空间结构和分析了MPP结构特征、结构中电荷分布特征、疏水特征及膜界能量学变化等物理学特性，从结构与能量学的角度为解释MPP穿膜机制提供了重要的数据。另外，从生物大分子治疗学角度，应用分子生物学技术构建及表达了MPP介导的特异性和非特异性两种转基因载体体系，进一步研究该载体体系的自身穿膜特性、穿膜介导特性、组织特异性穿膜特性及穿血脑
山西医科人学2003届博士学位论文
中文摘要
屏障介导特性等实验。为M即的应用提供基础研究数据。
1.MPP穿膜结构域的结构模拟及物理学特征分析
MPP穿膜区同源序列比较，氨基酸组成分析
MPP是一类一有介导生物人分子穿膜的功能多肤。这类特殊转导蛋白
进入细胞的机制还未阐明清楚，但是一些传导蛋白如:TAT、ANTP、VP22、
Perl等与传导有关的I)J能区一蛋白转导区(Protein transduetion domain，
PTD)己经明确。TAT蛋白的最基本转导单位是由n个氨基酸残基组成，
VPZ:的是267一300氨基酸残基区，ANTP氨基酸残基区是43一58;PERI蛋白
的PTD是 830一845氨基酸残基区。为了阐明M即穿膜的结构基础，我们对
常见的4种M即穿膜区进行了序列同源分析。发现了它们的氨基酸组成特
征，即该区域富含碱性氨基酸。TAT蛋白PTD区11个氨基酸中有8个碱性
氨基酸，其中2个赖氨酸(Lys)，6个精氨酸(Arg)，占73%。vP:2的PTD
区34个氨基酸中有9个碱性氨基酸，全是精氨酸(Arg)，，.‘26%，其中还
有8个丙氨酸(Ala)和5个Pro。ANTP的PTD的16个氨基酸中，有7个
碱性氨基酸，.ll’ 44%，其中4个Lys，3个Arg。PERI的PTD16个氨基酸中
有11个碱性氨基酸，:片69%，其中5个Arg，4个His和2个Lys。
2结构建模、优化及空间结构分析
在对PTD区的氨基酸同源性分析的基础上，我们进行了M即结构域的
结构模拟实验。我们在研究野生型PERI蛋白和其12个突变体的穿膜实验
中发现，这些肤的穿膜能力不同。我们就以13种肤的氨基酸一级结构序列
为对象，对hPERI一M即和其12个突变体均进行了建模、优化。结构优化完
成后，进行评估。利用Profi le一3D对局部二级结构类型、溶剂可及性和被
极性原子遮盖的侧链面积描述的残基所处的环境进行分析。由己知的蛋白
质结构及其序列统计出残基类型对环境类型的倾向性分数，据此来判别一
序列与其结构的兼容性。一个结构的评估分数是它的每一残基与局部环境
的倾向性分数的总和。此13个蛋白质结构Profile一3D评估结果显示，其
结构判别的上卜界为:5.42一12.05，这13个结构经优化后的Profile一3D
值均达到或接近结构判定的上界，说明蛋白质整体折叠是正确的，但是局
部折叠可能存在一些偏差。对13个经优化的结构显示:在13个结构中，
有10个结构(fhm，m3，m4，ms，m6，m7，ms，m12，m13，ml4)在MPP功能片段区
山西医科大学2003届博士学位论文
中文摘要
(12一27)有a一螺旋，同时m3，m4，m6，ms，m12和m14在。一螺旋后存
在一个转角。M即蛋自质做为一种能够与细胞膜相互作用的蛋自质，这种
‘级结构以。一螺旋为土的特性是与一些跨膜蛋白和与膜相互作用的蛋白
相一致的，如G蛋白偶连受体和细菌毒素细胞溶解素等。我们着重比较了
fh。和!m7两个结构，当我们将两个分子利用软件重叠后，显示彼此之间的
上链的RMSD为4.445078A。通过结构比较，我们可以石·到，当Alals取代
Arg18后，蛋白质C端的结构发生明显的变化，。一螺旋变短。在fhm，。-
螺旋由16一21位氨基酸构成，m7的。一螺旋由18一21位氨基酸构成。C端
结构域的在发生突变后，Q一螺旋两端的区域在空间上更为靠近.
1.3表面静电分布及越界自由能计算
用de加hi方程计算表面静电分布，用Insightl工软件观察到的表面电
势分布状况。结果显示，在fhm分子
引文
1. Joliot, A, et al. (1991) Antennapedia homeobox peptide regulates neural morphogenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88, 1864-1868
2. Schwarze, S.R and Dowdy. Dowdy, S.F. (2000) in vivo protin transduction: intracellular delivery of biologically active proteins, compounds and DNA. Trends Phammacol. Sci. 21, 45-48
3. Derossi, D. et al. (1994) the third helix of the Antennapedia homeodomain translocates through biological membranes. J. Biol. Chem. 269, 10444-10450
4. Derossi, D, et al. (1998) Trojan peptides: the penetratin system for intracellular delivery. Trends Cell Biol. 8, 84-87
5. Joliot, A.H. et al. (1991) α-2.8-polysialic acid is the neuronal surface receptor of Antennapedia homeobox peptide. New Biol. 3, 1121-1134
6. Chatelin, L et al. (1996) Transcription factor Hoxa-5 is taken up by cells in culture
and conveyed to their nuclei. Mech. Dev, 55, 1-7
7. Ruben, S. et al. (1989) Structural and functional characterization of human immunodeficiency virus Tat protein. J. Virol. 63, 1-8
8. Vogel, B.E. et al. (1993) A novel integrin specificity exemplified by binding of the α v β 5integrin to thebasic domain of the HIV Tat protein and vitronectin. J. Cell Biol. 121. 461-468
9. Elliott, G, and O Hare, P. (1997) Intercellular trafficking and protein delivery by herpesvirus structural protein. Cell 88, 223-233
10. Ensoli, B. et al (1993) Release, uptake, and effects of extracellular human immunodeficiency virus type 1Tat protein on cell growth and viral transactivation. J Virol. 67, 277-287
11. Frankel, A.D. and Frankel, A.D. and Pabo, C.O. (1988) Cellular uptake of the Tat protein fromhuman immunodeficiency virus. Cell 55, 1189-1193
12. Mann, D.A and Frankel, A.D (1991) Endocytosis and targeting of exogenous HIV- 1 Tat protein. EMBOJ. 10, 1733-1739
13. Morris. M.C. et al. (1997) A new peptide vector for efficient delivery of oligonucleotides into mammalan cells. Nudeic Acids Res. 25, 2730-2736
14. Fawell, S.et al. (1994) Tat-mediated delivery of heterologous proteins into cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91,664-668
15. Vives, e. et al. (1997) A truncated HIV-1 Tat protein basic domain rapidly translocates through the plasma membrane and accumulates in the cell nucleus. J. Biol Chem. 272, 16010-16017
16. Nagahara. H. et al. (1998) Transduction of full-length TAT fusion proteins into mammalian cells:TAT-p27 Kip induces cell migration. Nat. Med. 4, 1449-1452
17. Brodsky. J.L. (1998) Translocation of proteins actross the endoplasmic reticulum membrane. Int. Rev. Cyt. 178, 277-328
18. Lin, Y7, et al. (1996) Role of the nuclear localization sequence in fibroblist growth factor-1-stimulated mitogenic pathways. J. Biol. Chem. 271, 5305-5308
19. Liu, X. et al. (1996) Identification of a functionally important sequence in the cytoplasmic tail of integrin β by using cell-permeable peptide analogs. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93. 11819-11824
20. Morris. M.C. et al. (1997) A new peptide vector for efficient delivery of oligonucleotides into mammalan cells. Nudeic Acids Res. 25, 2730-2736
21. Chaloin, L. et al. (1997) Confomations of primary amphipathic carrier peptides in membrane mimicking environmenes. Biochemistry 36, 11179-11187
22. Zhang, L. et al. (1998) Preparation of functionally active cell-permeable peptides by single-step ligation of two petide modules. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95,
9184-9189
23. Chaloin, L. et al. (1998) Design of carrier peptide-oligonucleotide conjugates with rapid membrane translocation and nuclear localization properties. Biochem. Biophys. Res. Comman. 243,601-608
24. Lin, Y. et al. (1995) Inhibition of nuclear translocation of transcription factor NF-KB by synthetic peptide containing cell membranepermeable motif and nuclear localization sequence. J. Biol. Chem. 270. 14255-14258
25. Begley. D.J. (1996) The blood-brain barrier: principles for targeting peptides and drugs to the central nervous system. J. Phann. Pharmacol. 48, 136-146
26. Levin, V.A (1980) Relationship of octanol/water partition coefficient and molecular weitht to rat brain capillary permeability J. Mcd. Chem. 23,682-684
27. Elliott, G.and O'Hare, P.(1997) Intercellular trafficking and protein delivery b a herpesvirus structural protein. Cell 88,223-233
28. Joliot, A. et al. (1991) Antennapedia homeobox peptide regulates neural morphogeneis. Proc. Natl. Acad. Sci. U,S.A 88, 1864-1868
29. Green, M. and Loewenstein, P.M. (1988) Autonomous functional domains of chemically synthesized Human Immunodeficiency Virus Tat trans-activator protein. Ce1155, 1179-1188
30. Frakel, A.D. and Pabo, C.O.(1988) Cellular uptake of the tat protein from human immunodeficiency virus. Cell 55, 1189-1193
31. Mann, D.A. and Frankel, A.D. (1991) Endocytosis and targeting of exogenous HIV-1 Tat protein. EMBOJ.10, 1733-1739
32. Ezhevsky, S.A. et al. (1997) Hypophosphorylation of the retinoblastoma protein (pRb) by cyclinD:Cdk4/6 complexes results in active pRb. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 10699-10704
33. Vives, E. et al. (1997) A truncated HIV-1 Tat protein basic domain rapidly translocates throughthe plasma membrane and accumulates in the cell nucleus. J.Biol. Chem. 272, 16010-16017
34. Derossi, D. et al. (1994) The third helix of through biological membranes. J. Biol. Chem. 269, 10444-16017
35. Calnan, B.J. et al. (1991) Analysis of arginine-rich peptides from the HIV Tat protein reveals unusual features of RNA-protein recognition. Genes Dev. 5, 201-210
2. Schwarze, S.R and Dowdy. Dowdy, S.F. (2000) in vivo protin transduction: intracellular delivery of biologically active proteins, compounds and DNA. Trends Phammacol. Sci. 21, 45-48
3. Derossi, D. et al. (1994) the third helix of the Antennapedia homeodomain translocates through biological membranes. J. Biol. Chem. 269, 10444-10450
4. Derossi, D, et al. (1998) Trojan peptides: the penetratin system for intracellular delivery. Trends Cell Biol. 8, 84-87
5. Joliot, A.H. et al. (1991) α-2.8-polysialic acid is the neuronal surface receptor of Antennapedia homeobox peptide. New Biol. 3, 1121-1134
6. Chatelin, L et al. (1996) Transcription factor Hoxa-5 is taken up by cells in culture
and conveyed to their nuclei. Mech. Dev, 55, 1-7
7. Ruben, S. et al. (1989) Structural and functional characterization of human immunodeficiency virus Tat protein. J. Virol. 63, 1-8
8. Vogel, B.E. et al. (1993) A novel integrin specificity exemplified by binding of the α v β 5integrin to thebasic domain of the HIV Tat protein and vitronectin. J. Cell Biol. 121. 461-468
9. Elliott, G, and O Hare, P. (1997) Intercellular trafficking and protein delivery by herpesvirus structural protein. Cell 88, 223-233
10. Ensoli, B. et al (1993) Release, uptake, and effects of extracellular human immunodeficiency virus type 1Tat protein on cell growth and viral transactivation. J Virol. 67, 277-287
11. Frankel, A.D. and Frankel, A.D. and Pabo, C.O. (1988) Cellular uptake of the Tat protein fromhuman immunodeficiency virus. Cell 55, 1189-1193
12. Mann, D.A and Frankel, A.D (1991) Endocytosis and targeting of exogenous HIV- 1 Tat protein. EMBOJ. 10, 1733-1739
13. Morris. M.C. et al. (1997) A new peptide vector for efficient delivery of oligonucleotides into mammalan cells. Nudeic Acids Res. 25, 2730-2736
14. Fawell, S.et al. (1994) Tat-mediated delivery of heterologous proteins into cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91,664-668
15. Vives, e. et al. (1997) A truncated HIV-1 Tat protein basic domain rapidly translocates through the plasma membrane and accumulates in the cell nucleus. J. Biol Chem. 272, 16010-16017
16. Nagahara. H. et al. (1998) Transduction of full-length TAT fusion proteins into mammalian cells:TAT-p27 Kip induces cell migration. Nat. Med. 4, 1449-1452
17. Brodsky. J.L. (1998) Translocation of proteins actross the endoplasmic reticulum membrane. Int. Rev. Cyt. 178, 277-328
18. Lin, Y7, et al. (1996) Role of the nuclear localization sequence in fibroblist growth factor-1-stimulated mitogenic pathways. J. Biol. Chem. 271, 5305-5308
19. Liu, X. et al. (1996) Identification of a functionally important sequence in the cytoplasmic tail of integrin β by using cell-permeable peptide analogs. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93. 11819-11824
20. Morris. M.C. et al. (1997) A new peptide vector for efficient delivery of oligonucleotides into mammalan cells. Nudeic Acids Res. 25, 2730-2736
21. Chaloin, L. et al. (1997) Confomations of primary amphipathic carrier peptides in membrane mimicking environmenes. Biochemistry 36, 11179-11187
22. Zhang, L. et al. (1998) Preparation of functionally active cell-permeable peptides by single-step ligation of two petide modules. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95,
9184-9189
23. Chaloin, L. et al. (1998) Design of carrier peptide-oligonucleotide conjugates with rapid membrane translocation and nuclear localization properties. Biochem. Biophys. Res. Comman. 243,601-608
24. Lin, Y. et al. (1995) Inhibition of nuclear translocation of transcription factor NF-KB by synthetic peptide containing cell membranepermeable motif and nuclear localization sequence. J. Biol. Chem. 270. 14255-14258
25. Begley. D.J. (1996) The blood-brain barrier: principles for targeting peptides and drugs to the central nervous system. J. Phann. Pharmacol. 48, 136-146
26. Levin, V.A (1980) Relationship of octanol/water partition coefficient and molecular weitht to rat brain capillary permeability J. Mcd. Chem. 23,682-684
27. Elliott, G.and O'Hare, P.(1997) Intercellular trafficking and protein delivery b a herpesvirus structural protein. Cell 88,223-233
28. Joliot, A. et al. (1991) Antennapedia homeobox peptide regulates neural morphogeneis. Proc. Natl. Acad. Sci. U,S.A 88, 1864-1868
29. Green, M. and Loewenstein, P.M. (1988) Autonomous functional domains of chemically synthesized Human Immunodeficiency Virus Tat trans-activator protein. Ce1155, 1179-1188
30. Frakel, A.D. and Pabo, C.O.(1988) Cellular uptake of the tat protein from human immunodeficiency virus. Cell 55, 1189-1193
31. Mann, D.A. and Frankel, A.D. (1991) Endocytosis and targeting of exogenous HIV-1 Tat protein. EMBOJ.10, 1733-1739
32. Ezhevsky, S.A. et al. (1997) Hypophosphorylation of the retinoblastoma protein (pRb) by cyclinD:Cdk4/6 complexes results in active pRb. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 10699-10704
33. Vives, E. et al. (1997) A truncated HIV-1 Tat protein basic domain rapidly translocates throughthe plasma membrane and accumulates in the cell nucleus. J.Biol. Chem. 272, 16010-16017
34. Derossi, D. et al. (1994) The third helix of through biological membranes. J. Biol. Chem. 269, 10444-16017
35. Calnan, B.J. et al. (1991) Analysis of arginine-rich peptides from the HIV Tat protein reveals unusual features of RNA-protein recognition. Genes Dev. 5, 201-210