怀山药的组织培养及其相关研究
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摘要
本文第一章利用正交设计L_9(3~+)考察3种外源激素(IBA、NAA、6—BA)对怀山药(Dioscorea opposite Thunb)不带腋芽的节段的分化培养和植株再生的影响。IBA、NAA、6—BA的3个水平分别是0、0．4、0.8(mg／L，以下单位相同)，0.25、0.5、1.0，0.5、1.5、2.0。九个激素组合分别是：(1) 2.0 mg／L 6—BA+1.0 mg／LNAA+0.8 mg／LIBA，(2) 2.0 mg／L 6—BA+0.5 mg／LNAA+0.4 mg／LIBA，(3) 2.0 mg／L 6—BA+1.0 mg／LNAA+0.8 mg／LIBA，(4) 1.5 mg／L 6—BA+1.0 mg／LNAA+0.4 mg／LIBA，(5) 1.5 mg／L6—BA+0.5 mg／LNAA+0 mg／LIBA，(6) 1.5 mg／L 6—BA+0.25mg／LNAA+0.8 mg／LIBA，(7) 0.5 mg／L 6—BA+1.0 mg／LNAA+0mg／LIBA，(8) 0.5 mg／L 6—BA+0.5 mg／LNAA+0.8 mg／LIBA，(9) 0.5 mg／L 6—BA+0.25 mg／LNAA+0.4 mg／LIBA。通过本试验得到适合怀山药不带腋芽的节段分化培养的最佳培养基：改良MS+100g／L香蕉+0.5mg／L6-BA+1.0mg／LNAA+0.5％琼脂+0.5％活性炭+3％蔗糖。壮苗培养基为：改良MS+100g／L香蕉+0.5mg／LNAA+0.5％琼脂+0.5％活性炭+3％蔗糖。在转入生根壮苗培养基20天～30天，无菌苗形成圆形微型块茎(Microtuberization)，60天时形成率为100％，直径约为5mm～12mm，形成数量较多(一株可形成1～3个，且形成一个的较少)。
在本文中，首次对无菌苗的叶柄、茎段和根块在6-BA、NAA、IBA的不同浓度组合下直接分化成苗进行了探讨，选出的最适合这三种外植体直接分化成苗途径的激素组合分别是：最适无菌根块分化培养基是，改良的MS+100g／L香蕉+0.5 mg／L 6-BA+0.25 mg／L NAA+0.4mg／L IBA+0.5％琼脂+0.5％活性炭+3％蔗糖；最适无菌茎段分化的培养基是，改良MS+100g／L香蕉+0.5 mg／L 6-BA+0.5mg／L NAA+0.8mg／L IBA+0.5％琼脂+0.5％活性炭+3％蔗糖；最适无菌叶柄分化的培养基是，改良MS+100g／L香蕉+1.5／L 6-BA+0.25 mg／L NAA+0.5％琼脂+0.5％活性炭+3％蔗糖。通过试验首次实现叶柄和根块直接分化成苗，并且使茎段和根块的分化率达到了100％，并证明，无菌根块是研究怀山药直接分化成苗的一个良好的培养系统。
在本文的第三章采用火焰原子吸收法测定了山药组培微块茎和培养前后培养基中的K、Cu、Fe、Mn、Zn五种金属元素的含量。实验结果表明，除Cu外，其余四种元素的含量均高于相关报道文献数倍甚至数十倍(已有文献报道的山药成品中的钾2563～7147mg／L、锌2.4～7.2 mg／L、铁5.7～24 mg／L、锰0.3～3.8 mg／L、铜0.9～3.2 mg／L，而本试验测得的各金属元素的含量是钾132182.27 mg／L，铁126.43 mg／L，铜1.23 mg／L，锌31.06 mg／L，锰69.51 mg／L)，这也说明在组培条件下形成的微型块茎对金属元素的富积能力高于在自然生长条件下。培养基在培养前后，除Mn消耗明显外，其余元素无明显变化。
在样品的消解方法上，本试验提出了新的较为方便的方法：准确称取2.000g干燥样品于洁净的聚四氟乙烯烧杯中，加浓硝酸31ml，在电热炉上加热近干，再补加10～15ml浓高氯酸，继续加热，至溶液开始产生高氯酸白烟并变澄清透明，取下表面皿，加热赶尽高氯酸，用1％的硝酸定容至50ml待测。
In the first chapter of this paper, used orthogonal design L_9 (3~4) to inspect three exogenous hormone (IBA、NAA、6—BA) if they could be used to differentiate、cultivate and influence Dioscoreaopposite without axillary bud rebornd and form miniature tuber。The three level of the amount of IBA were 0, 0.4, 0.8mg/L, The three level of the scalar of The three level of the amount of NAA were 0.25, 0.5, 1.0 mg/L, The three level of the amount of 6-BA were 0.5, 1.5, 2.0. The nine kind of combinations with the three exogenous hormone were: (1)2.0 mg/L 6—BA+1.0 mg/LNAA+0.8 mg/LIBA, (2)2.0 mg/L 6—BA+0.5 mg/LNAA+0.4 mg/LIBA, (3)2.0 mg/L 6—BA+1.0 mg/LNAA+0.8 mg/LIBA, (4) 1.5 mg/L 6—BA+1.0 mg/LNAA+0.4 mg/LIBA, (5) 1.5 mg/L 6—BA+0.5 mg/LNAA+0 mg/LIBA, (6) 1.5 mg/L 6—BA+0.25 mg/LNAA+0.8 mg/LIBA, (7)0.5 mg/L 6—BA+1.0 mg/LNAA+0 mg/LIBA, (8) 0.5 mg/L 6—BA+0.5 mg/LNAA+0.8 mg/LIBA, (9)0.5 mg/L 6—BA+0.25 mg/LNAA +0.4 mg/LIBA. As the result of the test, we knew that: Using burls as explant, modified MS medium + banana 100g/L +0.5mg/L 6—BA+1.0mg/LNAA+0.5％agaragar+0.5％active carbon+3％sucrose was optimal medium culture. The regenerated plants grew robustly and flourishing. When the regenerated plants were transplanted onto modified MS medium supplemented with 0.5mg/L6-BAand1. 0mg/LNAAand 0.5％active carbon for 20～30days, these plants could form round Microtuberizations, after 60days, the rate of forming Microtuberizations was 100％, the diameter of these Microtuberizations was 5mm～12mm, so many the quantities of these Microtuberizations were(generally, one plant forming 1～3Microtuberizations, and one plant with only forming one Microtuberizations were less.
The text first time probed that leafstalks, stem and clumps of root of bioclean young plant directly was differentiatied to young plant in the different concentrations combination (6-BA、NAA、IBA)。Modified MS+banana 100g/L+0.5 mg/L6-BA+0.25 mg/LNAA+0. 4mg IBA +0.5％agaragar+0.5％active carbon+3％sucrose was the most suitable culture medium for boot tuber differentiation, modified MS+banana 100g/L+0.5 mg/L6-BA+0.5mg/LNAA+0.8g IBA +0.5％agaragar+0.5％active carbon+3％sucrose for shoot differentiation, and the most suitable medium culture for petiole differentiation was modified MS +banana 100g/L+1.5/L6-BA+0.25 mg/LNAA+0.5％agaragar+0.5％active carbon+3％sucrose. As the first time, used leafstalks and clumps of root as explants to directly be differentiated to reborned the plants, and the differentiation rate was completely 100％though the experiment of stem and clumps of root of bioclean young plant, at the same time, proved that the clumps of root of bioclean young plant was a good reborning system for directly differentiation.
In the third chapter of this article, discussed the mensuration of the flame atomic absorption spectrophotometry and the content about Cu、K、Fe、Mn、Zn in the minituber of the tissue culture Dioscorea OppositaThunb, the culture medium befroe transplanting the explant and the culture mediium after transplanting the explant. Initially proved that minituber of tissue culture had good quality of idioplasm, and minituber by tissue culture had more powerful ability to accumulating four metal just talked about except Cu, compared with the tuber that was in the nature growing conditions。The content of the K, Zn, Fe, Mn were higher than the relative literatures reported about several times or several ten times(as reported, about finished product of Dioscorea Opposita Thunb the quantity of the content were: K2563～7147mg/L, Zn2.4～7.2 mg/L, Fe5. 7～24 mg/L, Mn0. 3～3.8 mg/L, Cu0.9～3.2 mg/L, however, in this experiment, the result were K132182.27 mg/L , Fe126.43 mg/L, Zn31.06 mg/L, Mn69.51 mg/L and Cu 1.23 mg/L),. Contrasting the culture medium before or after transplanting the explant, the wastage of Mn was evidence, the content of the anther four metal element wereno obvious change.
The digestive method by HNO_3+HCLO_4 was applied in this test. This method is convenient, rapid and accurate.
在本文中，首次对无菌苗的叶柄、茎段和根块在6-BA、NAA、IBA的不同浓度组合下直接分化成苗进行了探讨，选出的最适合这三种外植体直接分化成苗途径的激素组合分别是：最适无菌根块分化培养基是，改良的MS+100g／L香蕉+0.5 mg／L 6-BA+0.25 mg／L NAA+0.4mg／L IBA+0.5％琼脂+0.5％活性炭+3％蔗糖；最适无菌茎段分化的培养基是，改良MS+100g／L香蕉+0.5 mg／L 6-BA+0.5mg／L NAA+0.8mg／L IBA+0.5％琼脂+0.5％活性炭+3％蔗糖；最适无菌叶柄分化的培养基是，改良MS+100g／L香蕉+1.5／L 6-BA+0.25 mg／L NAA+0.5％琼脂+0.5％活性炭+3％蔗糖。通过试验首次实现叶柄和根块直接分化成苗，并且使茎段和根块的分化率达到了100％，并证明，无菌根块是研究怀山药直接分化成苗的一个良好的培养系统。
在本文的第三章采用火焰原子吸收法测定了山药组培微块茎和培养前后培养基中的K、Cu、Fe、Mn、Zn五种金属元素的含量。实验结果表明，除Cu外，其余四种元素的含量均高于相关报道文献数倍甚至数十倍(已有文献报道的山药成品中的钾2563～7147mg／L、锌2.4～7.2 mg／L、铁5.7～24 mg／L、锰0.3～3.8 mg／L、铜0.9～3.2 mg／L，而本试验测得的各金属元素的含量是钾132182.27 mg／L，铁126.43 mg／L，铜1.23 mg／L，锌31.06 mg／L，锰69.51 mg／L)，这也说明在组培条件下形成的微型块茎对金属元素的富积能力高于在自然生长条件下。培养基在培养前后，除Mn消耗明显外，其余元素无明显变化。
在样品的消解方法上，本试验提出了新的较为方便的方法：准确称取2.000g干燥样品于洁净的聚四氟乙烯烧杯中，加浓硝酸31ml，在电热炉上加热近干，再补加10～15ml浓高氯酸，继续加热，至溶液开始产生高氯酸白烟并变澄清透明，取下表面皿，加热赶尽高氯酸，用1％的硝酸定容至50ml待测。
In the first chapter of this paper, used orthogonal design L_9 (3~4) to inspect three exogenous hormone (IBA、NAA、6—BA) if they could be used to differentiate、cultivate and influence Dioscoreaopposite without axillary bud rebornd and form miniature tuber。The three level of the amount of IBA were 0, 0.4, 0.8mg/L, The three level of the scalar of The three level of the amount of NAA were 0.25, 0.5, 1.0 mg/L, The three level of the amount of 6-BA were 0.5, 1.5, 2.0. The nine kind of combinations with the three exogenous hormone were: (1)2.0 mg/L 6—BA+1.0 mg/LNAA+0.8 mg/LIBA, (2)2.0 mg/L 6—BA+0.5 mg/LNAA+0.4 mg/LIBA, (3)2.0 mg/L 6—BA+1.0 mg/LNAA+0.8 mg/LIBA, (4) 1.5 mg/L 6—BA+1.0 mg/LNAA+0.4 mg/LIBA, (5) 1.5 mg/L 6—BA+0.5 mg/LNAA+0 mg/LIBA, (6) 1.5 mg/L 6—BA+0.25 mg/LNAA+0.8 mg/LIBA, (7)0.5 mg/L 6—BA+1.0 mg/LNAA+0 mg/LIBA, (8) 0.5 mg/L 6—BA+0.5 mg/LNAA+0.8 mg/LIBA, (9)0.5 mg/L 6—BA+0.25 mg/LNAA +0.4 mg/LIBA. As the result of the test, we knew that: Using burls as explant, modified MS medium + banana 100g/L +0.5mg/L 6—BA+1.0mg/LNAA+0.5％agaragar+0.5％active carbon+3％sucrose was optimal medium culture. The regenerated plants grew robustly and flourishing. When the regenerated plants were transplanted onto modified MS medium supplemented with 0.5mg/L6-BAand1. 0mg/LNAAand 0.5％active carbon for 20～30days, these plants could form round Microtuberizations, after 60days, the rate of forming Microtuberizations was 100％, the diameter of these Microtuberizations was 5mm～12mm, so many the quantities of these Microtuberizations were(generally, one plant forming 1～3Microtuberizations, and one plant with only forming one Microtuberizations were less.
The text first time probed that leafstalks, stem and clumps of root of bioclean young plant directly was differentiatied to young plant in the different concentrations combination (6-BA、NAA、IBA)。Modified MS+banana 100g/L+0.5 mg/L6-BA+0.25 mg/LNAA+0. 4mg IBA +0.5％agaragar+0.5％active carbon+3％sucrose was the most suitable culture medium for boot tuber differentiation, modified MS+banana 100g/L+0.5 mg/L6-BA+0.5mg/LNAA+0.8g IBA +0.5％agaragar+0.5％active carbon+3％sucrose for shoot differentiation, and the most suitable medium culture for petiole differentiation was modified MS +banana 100g/L+1.5/L6-BA+0.25 mg/LNAA+0.5％agaragar+0.5％active carbon+3％sucrose. As the first time, used leafstalks and clumps of root as explants to directly be differentiated to reborned the plants, and the differentiation rate was completely 100％though the experiment of stem and clumps of root of bioclean young plant, at the same time, proved that the clumps of root of bioclean young plant was a good reborning system for directly differentiation.
In the third chapter of this article, discussed the mensuration of the flame atomic absorption spectrophotometry and the content about Cu、K、Fe、Mn、Zn in the minituber of the tissue culture Dioscorea OppositaThunb, the culture medium befroe transplanting the explant and the culture mediium after transplanting the explant. Initially proved that minituber of tissue culture had good quality of idioplasm, and minituber by tissue culture had more powerful ability to accumulating four metal just talked about except Cu, compared with the tuber that was in the nature growing conditions。The content of the K, Zn, Fe, Mn were higher than the relative literatures reported about several times or several ten times(as reported, about finished product of Dioscorea Opposita Thunb the quantity of the content were: K2563～7147mg/L, Zn2.4～7.2 mg/L, Fe5. 7～24 mg/L, Mn0. 3～3.8 mg/L, Cu0.9～3.2 mg/L, however, in this experiment, the result were K132182.27 mg/L , Fe126.43 mg/L, Zn31.06 mg/L, Mn69.51 mg/L and Cu 1.23 mg/L),. Contrasting the culture medium before or after transplanting the explant, the wastage of Mn was evidence, the content of the anther four metal element wereno obvious change.
The digestive method by HNO_3+HCLO_4 was applied in this test. This method is convenient, rapid and accurate.
引文
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