He-Ne激光诱变香菇原生质体选育速生高产菌株及香菇液体深层发酵工艺研究
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摘要
本文采用激光技术与微生物原生质体育种技术相结合，选育香菇速生高产新菌株。并研究了所选育的新菌株在深层培养条件下的最佳发酵工艺条件，为香菇工业化生产液体菌种打下了良好的基础。
实验结果表明，香菇原生质体制备与再生的最佳条件为：采用对数生长期的菌体，2％溶壁酶，在32℃下酶解2.5—3hr，原生质体产率达到2.81×10~6个/mL；制备的原生质体，在含0.6mol/1MgSO_4的高渗培养基上培养，再生率为3.24％。
采用波长为632.8nm的He-Ne激光，以不同剂量辐照香菇135原生质体，所选的变异株经酯酶同工酶谱分析，其酶带条纹数，迁移率等均发生了显著变化；斜面培养，液体培养分析表明变异株与对照相比生长速率和生物量发生了明显变化。说明其遗传物质发生了改变，且不同剂量的He-Ne激光对香菇原生质体的诱变效果有差异。表明激光对香菇是一种有良好应用前景的诱变剂。
本文从工业化角度出发，研究了香菇的液体深层培养情况，考察了培养过程中还原糖，氨基氮，pH等参数随菌丝生长的变化规律；研究了不同培养基配方，不同接种方式，对菌丝量的影响，筛选出最佳培养基配方，发酵工艺条件。
In this paper, with laser-irradiation and protoplast technique, the mutants were screened whose mycelial growth speed was increased. We studied the submerged cultivation of the mutants, offering the base of modern fermation technique.
The result showed that protoplasts were easier to be obtained when Lentinus edodes were cultured to the mid-later exponential stage, while the mycelium co-treated with 2% Lywallzyme, at 32. And the regeneration frequencies reached to 3.24% on hyperosmotic medium containing 0.6M MgSCX
He-Ne laser (A =632.8nm) irradiated protoplasts for different time. The analysis of esterase isoenzyme indicated that the mutants' esterase is-enzyme patterns were of great difference from the starting strain. Solid culture, liquid culture told the mutants' mycelial growth speed and biomass were different from starting strain too. So it was concluded the mutants genetic substances had changed and different doses had different effect on protoplasts. Laser is a good mutagen.
From the industrial angle, we studied the submerged cultivation of the mutants; discussing the law of a series of parameters, for example, reducing sugar, amino nitrogen, pH with the change of mycelia growth in the course of activation. After studied the effect on wet mycelial amount of the different medium, different inoculation methods, we got the best fermentative media and fermentative procedure.
实验结果表明，香菇原生质体制备与再生的最佳条件为：采用对数生长期的菌体，2％溶壁酶，在32℃下酶解2.5—3hr，原生质体产率达到2.81×10~6个/mL；制备的原生质体，在含0.6mol/1MgSO_4的高渗培养基上培养，再生率为3.24％。
采用波长为632.8nm的He-Ne激光，以不同剂量辐照香菇135原生质体，所选的变异株经酯酶同工酶谱分析，其酶带条纹数，迁移率等均发生了显著变化；斜面培养，液体培养分析表明变异株与对照相比生长速率和生物量发生了明显变化。说明其遗传物质发生了改变，且不同剂量的He-Ne激光对香菇原生质体的诱变效果有差异。表明激光对香菇是一种有良好应用前景的诱变剂。
本文从工业化角度出发，研究了香菇的液体深层培养情况，考察了培养过程中还原糖，氨基氮，pH等参数随菌丝生长的变化规律；研究了不同培养基配方，不同接种方式，对菌丝量的影响，筛选出最佳培养基配方，发酵工艺条件。
In this paper, with laser-irradiation and protoplast technique, the mutants were screened whose mycelial growth speed was increased. We studied the submerged cultivation of the mutants, offering the base of modern fermation technique.
The result showed that protoplasts were easier to be obtained when Lentinus edodes were cultured to the mid-later exponential stage, while the mycelium co-treated with 2% Lywallzyme, at 32. And the regeneration frequencies reached to 3.24% on hyperosmotic medium containing 0.6M MgSCX
He-Ne laser (A =632.8nm) irradiated protoplasts for different time. The analysis of esterase isoenzyme indicated that the mutants' esterase is-enzyme patterns were of great difference from the starting strain. Solid culture, liquid culture told the mutants' mycelial growth speed and biomass were different from starting strain too. So it was concluded the mutants genetic substances had changed and different doses had different effect on protoplasts. Laser is a good mutagen.
From the industrial angle, we studied the submerged cultivation of the mutants; discussing the law of a series of parameters, for example, reducing sugar, amino nitrogen, pH with the change of mycelia growth in the course of activation. After studied the effect on wet mycelial amount of the different medium, different inoculation methods, we got the best fermentative media and fermentative procedure.
引文
[1]严泽湘，香菇的营养与食疗，食用菌，2000(1)：42—42
[2]吕柏盛，香菇室外袋料栽培技术，生物学通报，1995，Vol(30)：38—39
[3]吕作舟，刘巧云，我国香菇育种的回顾与展望，中国食用菌，1996，Vol15(1)：5—7
[4]陈五岭等，He-Ne激光在香菇速生高产菌株选育中的应用——酶酶同工酶分析及中试栽培，光子学报，1997(11)：977—981
[5]向洋，激光生物学 湖南科学技术出版社，1995；31—224
[6]黄耀熊，国外激光，激光生物医学的最新进展和发展趋向，1993，7：1—5
[7]Kana.J.S. et al, Archives Surgery, 1981(Mar), 116(3):292-296
[8]赵学武等，激光对生产β—胡萝卜素的藻种——盐生杜氏藻诱变的研究，中国激光，1992，19(6)：463-466
[9]Fine S. and E. Klein, laser Focus., 1969(July), 5(3):28-36
[10]许春帆等，激光及其临床应用，南京：江苏科学技术出版社，1983：96
[11]Ramabhardran. T. V. et al., Prot. Natl. Acad. Sci. USA, 1976, 73:59-63
[12]杨天波等，二氧化碳激光对果胶酶产生菌ASP．3．396发酵期产酶性能的影响，应用激光，1985，5(5)：221—222
[13]方善康等，生淀粉糖化酶菌种黑曲霉S—1的激光选育，中国激光，1988，15(7)：447—448
[14]吴振倡等，氮分子激光对谷氨酸菌诱变效应的研究，激光与红外，1990，20(4)：46—49
[15]吴振倡等，铜蒸气激光辐射棘孢小单孢菌的研究，中国激光，1985，12(11)；654—657
[16]吴振倡等，金霉素链霉菌高产株激光辐照的研究，中国激光，1992，19(7)：555—557
[17]吴振倡等，龟裂链霉菌高产株激光辐照的研究，中国激光，1993，20(8)：630—632
[18]陈五岭等，He-Ne激光诱变原生质体选育四环素高产菌株的研究，光子学报，1998(5)：412—417
[19] 陈五岭等，氮氖激光辐照红霉素链霉菌诱变育种的研究，光子学报，1998(6)：539—542
[20] 陈五岭等，氦氖激光对链霉菌原生质体种间融合频率的影响，光子学报，1998(5)：412—417
[21] 陈五岭等，氦氖激光在红霉素链霉菌和龟裂链霉菌灭活原生质体融合中的应用——激光对灭活原生质体融合频率的影响，光子学报，1998(7)：645—650
[22] 陈五岭等，氦氖激光在红霉素链霉菌和龟裂链霉菌灭活原生质体融合中的应用——融合子的分析鉴定，光子学报，1998(7)：651—655
[23] 陈五岭等，氦氖激光在香菇速生产菌株选育中的应用——菌株的诱变及选育，光子学报，1997(11)：972—975
[24] 毛宁等，激光诱变双孢蘑菇酯酶同工酶的研究，中国食用菌，1997，Vol16(2)：15-17
[25] 梁宏，激光微束照射与生物工程，国外激光，1989(16)：1-3
[26] 谭石慈等，用激光在蚕卵上植入染色质引起变异，中国激光，1986，13(9)：583-585
[27] Salton, M. R, Nature, 1952,170:746
[28] Weibull, C., Baceriol.,1953,66:688
[29] Hirosuke, et al: FEBS Letters., 113(1): 58-61, 1980
[30] Peberdy, J. F: Enzyme Microl. Technol., 2(1): 23-29,1980
[31] Klinner, U. et al: J. Basic.Microbiol., 25(4): 233-241,1985
[32] Beggs, J. D: Nature, 275:104-109.(4):
[33] 戴秉丽，原生质体技术在食用菌育种的应用研究，中国食用菌，1995，vol 14(5)：15-19
[34] Yoo YB et al., 1989. Interorder protoplast fusion between Pleurobus ostreats and Ganoderma applanatum, Kor J Mycol 17(3): 119-123.
[35] Liang ER & Chang ST, 1989, A Study on intergeneric by hybridization between Pleurotus sajor-caju and Schizophyllum commune, by protoplast fusion, Mushroom Science 12 (part Ⅰ):125-137.
[36]王澄辙等，2000，凤尾菇和香菇原生质体非对称融合，19(3)：413—415，菌物系统
[37]赵永昌 食用菌原生质体研究的发展史 中国食用菌 1995，Vol 14(4)：3-7
[38]Mwkberjee. M.,Regeneration and Mutagenization of protoplasts of Volv ariella volvacea mycelia.Applied and Environmental Microbiology. 1986,12:1412-1414.
[39]Santiago-CM Jr. et al. Strain improvement of selected species of edible fungi. Philippine-Journal-of-Science 1991,120(2):159-179.
[40]Zhem chuzhina-Ns, et al. Use of mycelial protoplasts of Pyricularia oryzae Cav. to obtain recessive mutations. Problemy identifikatsim-mikroskop icheskikh-gribov-drugikh-microorganizmov. 1987,31.
[41]Lee Jae-Sung, et al. Release, regeneration and mutant induction of Plourotus comucopiae("Tamogitake")protoplasts, Agric. Biolchem, 1988,52(7):1877-1878.
[42]Yumri. M. Fruiting body formation from regenerated mycelium of Pleurotus ostreatus protoplasts Appl. And Envio. Microbio, 1985, 49(2):441-442.
[43]梁枝荣等，香菇原生质体分离诱变育种研究，微生物学通报，2001，28(2)：38—39
[44]李刚等，原生质体紫外诱变选育灵芝新菌种的研究，微生物学通报，2001，4(2)，229—233
[45]胡能书等，同工酶技术及其应用，湖南科学技术出版社，1985
[46]Market, C. L. & F. Moiler, Proc. Nat, Acad. Sci, 1959, 45:753
[47]张用梅等，苏云金杆菌的酯酶分析，微生物学通报，1981，21(1)：197—203
[48]Selander, R. et al, A β β1.Envi ron. Microbiol. 1986,51:873
[49]陈都珍等，凤尾菇酯酶同工酶及其氯基酸含量的变化，真菌学报，1987，6(1)：34—41
[50]余韶颜等，21株香菇菌株的酯酶同工酶研究，食用菌，1993，15(4)：7
[51]向洋等，激光生物学，1993，2(4)：37
[52]朱宝成等，紫孢侧耳糙皮侧耳及其融合菌株的同工酶分析 遗传，1995，17(4)：37—39
[53]陈五岭等，酯酶同工酶技术在选育BT新菌种中的应用，西北大学学报(自然科学版)，1997，27(2)：179
[54]管萍等，同工酶技术在金菌素链霉菌鉴别中的应用，西北大学学报(自然科学版)，1996，26(6)：533
[55]袁彤光，食用菌液体菌种深层发酵技术应用综述，食用菌，1995，17(3)：6—7
[56]胡贵权，食用菌液体菌种的制作及应用，食用菌，1998，20(1)：17—18
[57]单慰曾等，香菇液体培养的基本生理研究，中国食用菌，1994，13(1)：38—40
[58]林剑一等，溶氧参数对食用菌深层培养的影响，食用菌，1999(20)：7—8
[59]李宗义等，淀粉废液发酵香菇菌丝体，中国食用菌，1998，17(1)：17—19
[60]周素荣，金针菇，草菇，香菇和红灵芝液体培养探讨，中国食用菌，1993，12(3)：35—37
[61]袁彤光等，浅析影响香菇液体菌种在生料中生长的因素，中国食用菌，1994，12(1)：24—26
[62]黄祖荫，平菇液体菌种制作技术及栽培技术实验，食用菌，1995，17(1)：9—10
[63]纪秀娥等，青霉素对平菇菌丝生长的影响，食用菌，1999，21(5)：5—6
[64]邵伟等，茯苓液体发酵条件的研究，食用菌，1999，21(4)：2—3
[65]杜昱光等，(18—19)竹荪深层培养的理化因子研究，中国食用菌，1996，15(2)：37—40
[66]杨革，灵芝菌丝体深层培养及多糖提取工艺研究 生物学杂志，1997，14(2)：16—17
[67]王磊等，草菇液体发酵摇瓶实验初报，中国食用菌，1995，14(2)；43—44
[68]樊璐等，草灵芝菌丝液体培养的复因子筛选，中国食用菌，1995，14(6)：23—24
[69]尚德静等，冬虫夏草深层发酵的研究，中国食用菌，1995，14(6)：23—24．
[70]管萍，同工酶技术在微生物和植物杂交鉴定中的应用，西北大学学报(自然科学版)，1994：15—16．
[71]孙启玲等，灭活酵母细胞原生质体融合技术的研究，四川大学学报(自然科学版)，1991，78(3)：366—372．
[72]洪盐国等，棒状杆菌灭活原生质体种间融合，遗传，1988，10(3)：24—27，
[73]Sumner J B.J B. Jbiol Chem 1925,63:393.
[74]中山大学生物系生化微生物学教研室 生化技术导论，人民教育出版社1982：35—36．
[75]李东屏，丝状真菌原生质体技术研究，湖南师范大学(自然科学版)，1997 20(2)：82—86．
[76]Peberdy FJ(1979) Fungal protoplasts: isolation, reversion and fusion. Ann Rev Microbiol 33:21-39.
[77]刘振钦，平菇和榆黄蘑原生质体分离与融合的研究，食用菌，96(1)：13—14．
[78]Baltz, R.H.&.P. Matsushima. J. Gen. Microbiol. 1981,127:137.
[79]Shirahama, T. et al.Agril. Biolchem. 1981,45(5):1271.
[80]Dominique G.& Michel F, 1982, protoplast production from Saprolegmia Monoica. Microbios, 34:89-98.
[81]梁平彦等，产黄青霉两株营养缺陷型原生质体的形成与再生的研究，植物生理学报，1981，7(1)：1—10．
[82]De Vrise OMH, Wessels JGH(1792) Release of protoplasts from Schfzo phylum commune by a lyric enzyme preparation from Trichoderma vfrfde. J Gen Microbiol. 73:13-22.
[83]Susum W, Magae Y(1985)Formation of giant protoplasts of Pleurotus cornucopiae by the cell wall lytic enzyme, Appl Microbiol Biotechnol 21:328-330.
[84]Magae Y, Kakimoto Y, Kashiwagi Y, SasakiT(1985)Fruiting baly for mation from regenerated mycelium of Plewrotws ostreatus protoplasts. Appl Enviro Microbiol 49:441-442.
[85]Basford, J. R. Laser Surg. Med, 1989,9:1.
[2]吕柏盛，香菇室外袋料栽培技术，生物学通报，1995，Vol(30)：38—39
[3]吕作舟，刘巧云，我国香菇育种的回顾与展望，中国食用菌，1996，Vol15(1)：5—7
[4]陈五岭等，He-Ne激光在香菇速生高产菌株选育中的应用——酶酶同工酶分析及中试栽培，光子学报，1997(11)：977—981
[5]向洋，激光生物学 湖南科学技术出版社，1995；31—224
[6]黄耀熊，国外激光，激光生物医学的最新进展和发展趋向，1993，7：1—5
[7]Kana.J.S. et al, Archives Surgery, 1981(Mar), 116(3):292-296
[8]赵学武等，激光对生产β—胡萝卜素的藻种——盐生杜氏藻诱变的研究，中国激光，1992，19(6)：463-466
[9]Fine S. and E. Klein, laser Focus., 1969(July), 5(3):28-36
[10]许春帆等，激光及其临床应用，南京：江苏科学技术出版社，1983：96
[11]Ramabhardran. T. V. et al., Prot. Natl. Acad. Sci. USA, 1976, 73:59-63
[12]杨天波等，二氧化碳激光对果胶酶产生菌ASP．3．396发酵期产酶性能的影响，应用激光，1985，5(5)：221—222
[13]方善康等，生淀粉糖化酶菌种黑曲霉S—1的激光选育，中国激光，1988，15(7)：447—448
[14]吴振倡等，氮分子激光对谷氨酸菌诱变效应的研究，激光与红外，1990，20(4)：46—49
[15]吴振倡等，铜蒸气激光辐射棘孢小单孢菌的研究，中国激光，1985，12(11)；654—657
[16]吴振倡等，金霉素链霉菌高产株激光辐照的研究，中国激光，1992，19(7)：555—557
[17]吴振倡等，龟裂链霉菌高产株激光辐照的研究，中国激光，1993，20(8)：630—632
[18]陈五岭等，He-Ne激光诱变原生质体选育四环素高产菌株的研究，光子学报，1998(5)：412—417
[19] 陈五岭等，氮氖激光辐照红霉素链霉菌诱变育种的研究，光子学报，1998(6)：539—542
[20] 陈五岭等，氦氖激光对链霉菌原生质体种间融合频率的影响，光子学报，1998(5)：412—417
[21] 陈五岭等，氦氖激光在红霉素链霉菌和龟裂链霉菌灭活原生质体融合中的应用——激光对灭活原生质体融合频率的影响，光子学报，1998(7)：645—650
[22] 陈五岭等，氦氖激光在红霉素链霉菌和龟裂链霉菌灭活原生质体融合中的应用——融合子的分析鉴定，光子学报，1998(7)：651—655
[23] 陈五岭等，氦氖激光在香菇速生产菌株选育中的应用——菌株的诱变及选育，光子学报，1997(11)：972—975
[24] 毛宁等，激光诱变双孢蘑菇酯酶同工酶的研究，中国食用菌，1997，Vol16(2)：15-17
[25] 梁宏，激光微束照射与生物工程，国外激光，1989(16)：1-3
[26] 谭石慈等，用激光在蚕卵上植入染色质引起变异，中国激光，1986，13(9)：583-585
[27] Salton, M. R, Nature, 1952,170:746
[28] Weibull, C., Baceriol.,1953,66:688
[29] Hirosuke, et al: FEBS Letters., 113(1): 58-61, 1980
[30] Peberdy, J. F: Enzyme Microl. Technol., 2(1): 23-29,1980
[31] Klinner, U. et al: J. Basic.Microbiol., 25(4): 233-241,1985
[32] Beggs, J. D: Nature, 275:104-109.(4):
[33] 戴秉丽，原生质体技术在食用菌育种的应用研究，中国食用菌，1995，vol 14(5)：15-19
[34] Yoo YB et al., 1989. Interorder protoplast fusion between Pleurobus ostreats and Ganoderma applanatum, Kor J Mycol 17(3): 119-123.
[35] Liang ER & Chang ST, 1989, A Study on intergeneric by hybridization between Pleurotus sajor-caju and Schizophyllum commune, by protoplast fusion, Mushroom Science 12 (part Ⅰ):125-137.
[36]王澄辙等，2000，凤尾菇和香菇原生质体非对称融合，19(3)：413—415，菌物系统
[37]赵永昌 食用菌原生质体研究的发展史 中国食用菌 1995，Vol 14(4)：3-7
[38]Mwkberjee. M.,Regeneration and Mutagenization of protoplasts of Volv ariella volvacea mycelia.Applied and Environmental Microbiology. 1986,12:1412-1414.
[39]Santiago-CM Jr. et al. Strain improvement of selected species of edible fungi. Philippine-Journal-of-Science 1991,120(2):159-179.
[40]Zhem chuzhina-Ns, et al. Use of mycelial protoplasts of Pyricularia oryzae Cav. to obtain recessive mutations. Problemy identifikatsim-mikroskop icheskikh-gribov-drugikh-microorganizmov. 1987,31.
[41]Lee Jae-Sung, et al. Release, regeneration and mutant induction of Plourotus comucopiae("Tamogitake")protoplasts, Agric. Biolchem, 1988,52(7):1877-1878.
[42]Yumri. M. Fruiting body formation from regenerated mycelium of Pleurotus ostreatus protoplasts Appl. And Envio. Microbio, 1985, 49(2):441-442.
[43]梁枝荣等，香菇原生质体分离诱变育种研究，微生物学通报，2001，28(2)：38—39
[44]李刚等，原生质体紫外诱变选育灵芝新菌种的研究，微生物学通报，2001，4(2)，229—233
[45]胡能书等，同工酶技术及其应用，湖南科学技术出版社，1985
[46]Market, C. L. & F. Moiler, Proc. Nat, Acad. Sci, 1959, 45:753
[47]张用梅等，苏云金杆菌的酯酶分析，微生物学通报，1981，21(1)：197—203
[48]Selander, R. et al, A β β1.Envi ron. Microbiol. 1986,51:873
[49]陈都珍等，凤尾菇酯酶同工酶及其氯基酸含量的变化，真菌学报，1987，6(1)：34—41
[50]余韶颜等，21株香菇菌株的酯酶同工酶研究，食用菌，1993，15(4)：7
[51]向洋等，激光生物学，1993，2(4)：37
[52]朱宝成等，紫孢侧耳糙皮侧耳及其融合菌株的同工酶分析 遗传，1995，17(4)：37—39
[53]陈五岭等，酯酶同工酶技术在选育BT新菌种中的应用，西北大学学报(自然科学版)，1997，27(2)：179
[54]管萍等，同工酶技术在金菌素链霉菌鉴别中的应用，西北大学学报(自然科学版)，1996，26(6)：533
[55]袁彤光，食用菌液体菌种深层发酵技术应用综述，食用菌，1995，17(3)：6—7
[56]胡贵权，食用菌液体菌种的制作及应用，食用菌，1998，20(1)：17—18
[57]单慰曾等，香菇液体培养的基本生理研究，中国食用菌，1994，13(1)：38—40
[58]林剑一等，溶氧参数对食用菌深层培养的影响，食用菌，1999(20)：7—8
[59]李宗义等，淀粉废液发酵香菇菌丝体，中国食用菌，1998，17(1)：17—19
[60]周素荣，金针菇，草菇，香菇和红灵芝液体培养探讨，中国食用菌，1993，12(3)：35—37
[61]袁彤光等，浅析影响香菇液体菌种在生料中生长的因素，中国食用菌，1994，12(1)：24—26
[62]黄祖荫，平菇液体菌种制作技术及栽培技术实验，食用菌，1995，17(1)：9—10
[63]纪秀娥等，青霉素对平菇菌丝生长的影响，食用菌，1999，21(5)：5—6
[64]邵伟等，茯苓液体发酵条件的研究，食用菌，1999，21(4)：2—3
[65]杜昱光等，(18—19)竹荪深层培养的理化因子研究，中国食用菌，1996，15(2)：37—40
[66]杨革，灵芝菌丝体深层培养及多糖提取工艺研究 生物学杂志，1997，14(2)：16—17
[67]王磊等，草菇液体发酵摇瓶实验初报，中国食用菌，1995，14(2)；43—44
[68]樊璐等，草灵芝菌丝液体培养的复因子筛选，中国食用菌，1995，14(6)：23—24
[69]尚德静等，冬虫夏草深层发酵的研究，中国食用菌，1995，14(6)：23—24．
[70]管萍，同工酶技术在微生物和植物杂交鉴定中的应用，西北大学学报(自然科学版)，1994：15—16．
[71]孙启玲等，灭活酵母细胞原生质体融合技术的研究，四川大学学报(自然科学版)，1991，78(3)：366—372．
[72]洪盐国等，棒状杆菌灭活原生质体种间融合，遗传，1988，10(3)：24—27，
[73]Sumner J B.J B. Jbiol Chem 1925,63:393.
[74]中山大学生物系生化微生物学教研室 生化技术导论，人民教育出版社1982：35—36．
[75]李东屏，丝状真菌原生质体技术研究，湖南师范大学(自然科学版)，1997 20(2)：82—86．
[76]Peberdy FJ(1979) Fungal protoplasts: isolation, reversion and fusion. Ann Rev Microbiol 33:21-39.
[77]刘振钦，平菇和榆黄蘑原生质体分离与融合的研究，食用菌，96(1)：13—14．
[78]Baltz, R.H.&.P. Matsushima. J. Gen. Microbiol. 1981,127:137.
[79]Shirahama, T. et al.Agril. Biolchem. 1981,45(5):1271.
[80]Dominique G.& Michel F, 1982, protoplast production from Saprolegmia Monoica. Microbios, 34:89-98.
[81]梁平彦等，产黄青霉两株营养缺陷型原生质体的形成与再生的研究，植物生理学报，1981，7(1)：1—10．
[82]De Vrise OMH, Wessels JGH(1792) Release of protoplasts from Schfzo phylum commune by a lyric enzyme preparation from Trichoderma vfrfde. J Gen Microbiol. 73:13-22.
[83]Susum W, Magae Y(1985)Formation of giant protoplasts of Pleurotus cornucopiae by the cell wall lytic enzyme, Appl Microbiol Biotechnol 21:328-330.
[84]Magae Y, Kakimoto Y, Kashiwagi Y, SasakiT(1985)Fruiting baly for mation from regenerated mycelium of Plewrotws ostreatus protoplasts. Appl Enviro Microbiol 49:441-442.
[85]Basford, J. R. Laser Surg. Med, 1989,9:1.