六神丸诱导HL-60细胞凋亡的实验研究
摘要
目的：
1．从细胞凋亡角度探讨六神丸治疗白血病的机理，为临床应用提供依据。
2．老药新用，扩大六神丸的应用范围。
方法：
1．中药血清药理学方法制备六神丸含药血清。
2．以乙醇为溶媒，沙氏回流法提取六神丸。
3．MTT法测定六神丸对HL-60细胞的增殖抑制作用。
4．吉姆萨染色法观察细胞凋亡的形态学变化。
5．原位末端标记(POD法)检测细胞凋亡。
结果：
1．MTT法表明：六神丸乙醇提取剂对HL-60细胞有明显的增殖抑制作用，且呈浓度依赖关系，IC_(50)为0.5μg／ml；中剂量组所得六神丸含药血清对HL-60细胞增殖抑制优于低剂量组和高剂量组。
2．吉姆萨染色显示六神丸乙醇提取剂和六神丸含药血清处理过的HL-60细胞均出现典型的凋亡形态，如细胞膜皱缩、染色质固缩碎裂、凋亡小体形成等。
3．原位末端标记表明：六神丸乙醇提取剂诱导HL-60细胞凋亡在一定范围内呈时间-浓度依赖关系；六神丸含药血清诱导HL-60细胞凋亡作用优于As_2O_3血清组和空白血清组(P＜0.01)。
结论：
六神丸体外可以诱导HL-60细胞凋亡，诱导细胞凋亡是六神丸治疗白血病的可能机理之一。
Purpose
l.To explore the mechanism of liu-shen-wan in treating AML from inducing apoptosis and to supply the theorical basis in clinical therapy.
2.To enlarge the clinical application of liu-shen-wan. Method
I.Chinese herbs serum pharmacology method produces medicine serum of Liu-Shen-Wan
2.Sha shi distillation method extracts Liu-Shen-Wan, with alcohol as the solvent.
3.MTT assay detects the growth inhibition effect of Liu-Shen-Wan on HL-60 cells.
4.GIMSA dying assay observes morphology changes of apoptosis.
5.In situ end-labeling method (POD) probes apoptosis phenomena Results
l.MTT assay indicates:Liu-Shen-Wan alcohol extraction has obvious growth inhibition effect on HL-60 cells, and has dependency on concentration. ICso is 0.5ug/ml. As far as the growth inhibition effect is concerned, the middle-dose group of Liu-Shen-Wan medicine-serum is superior to the low-dose group and high-dose group.
2.GIMSA dying assay exhibits: HI-60 cells dealed with Liu-Shen-wan alcohol extraction and Liu-Shen-Wan medicine-serum presents typical apoptosis morphology, such as cell membrane shrinkage, chromatin contraction and rupture, apoptosis body formation.
3.In situ end-labeling method (POD) indicates:HL-60 cells apoptosis induced by Liu-Shen-Wan alcohol extraction have time-concentration dependency relation within certain ranges; The HL-60 cells apoptosis effect induced by Liu-Shen-Wan medicine-serum is superior to AS2O3 serum group and blank serum group.(P<0.01)
Conclusions
Lin-shen-wan can induce apoptosis in HL-60 cells in vito.Inducing apoptosis is one of possible mechanisms in treating AL by Liu-Shen-Wan.
1．从细胞凋亡角度探讨六神丸治疗白血病的机理，为临床应用提供依据。
2．老药新用，扩大六神丸的应用范围。
方法：
1．中药血清药理学方法制备六神丸含药血清。
2．以乙醇为溶媒，沙氏回流法提取六神丸。
3．MTT法测定六神丸对HL-60细胞的增殖抑制作用。
4．吉姆萨染色法观察细胞凋亡的形态学变化。
5．原位末端标记(POD法)检测细胞凋亡。
结果：
1．MTT法表明：六神丸乙醇提取剂对HL-60细胞有明显的增殖抑制作用，且呈浓度依赖关系，IC_(50)为0.5μg／ml；中剂量组所得六神丸含药血清对HL-60细胞增殖抑制优于低剂量组和高剂量组。
2．吉姆萨染色显示六神丸乙醇提取剂和六神丸含药血清处理过的HL-60细胞均出现典型的凋亡形态，如细胞膜皱缩、染色质固缩碎裂、凋亡小体形成等。
3．原位末端标记表明：六神丸乙醇提取剂诱导HL-60细胞凋亡在一定范围内呈时间-浓度依赖关系；六神丸含药血清诱导HL-60细胞凋亡作用优于As_2O_3血清组和空白血清组(P＜0.01)。
结论：
六神丸体外可以诱导HL-60细胞凋亡，诱导细胞凋亡是六神丸治疗白血病的可能机理之一。
Purpose
l.To explore the mechanism of liu-shen-wan in treating AML from inducing apoptosis and to supply the theorical basis in clinical therapy.
2.To enlarge the clinical application of liu-shen-wan. Method
I.Chinese herbs serum pharmacology method produces medicine serum of Liu-Shen-Wan
2.Sha shi distillation method extracts Liu-Shen-Wan, with alcohol as the solvent.
3.MTT assay detects the growth inhibition effect of Liu-Shen-Wan on HL-60 cells.
4.GIMSA dying assay observes morphology changes of apoptosis.
5.In situ end-labeling method (POD) probes apoptosis phenomena Results
l.MTT assay indicates:Liu-Shen-Wan alcohol extraction has obvious growth inhibition effect on HL-60 cells, and has dependency on concentration. ICso is 0.5ug/ml. As far as the growth inhibition effect is concerned, the middle-dose group of Liu-Shen-Wan medicine-serum is superior to the low-dose group and high-dose group.
2.GIMSA dying assay exhibits: HI-60 cells dealed with Liu-Shen-wan alcohol extraction and Liu-Shen-Wan medicine-serum presents typical apoptosis morphology, such as cell membrane shrinkage, chromatin contraction and rupture, apoptosis body formation.
3.In situ end-labeling method (POD) indicates:HL-60 cells apoptosis induced by Liu-Shen-Wan alcohol extraction have time-concentration dependency relation within certain ranges; The HL-60 cells apoptosis effect induced by Liu-Shen-Wan medicine-serum is superior to AS2O3 serum group and blank serum group.(P<0.01)
Conclusions
Lin-shen-wan can induce apoptosis in HL-60 cells in vito.Inducing apoptosis is one of possible mechanisms in treating AL by Liu-Shen-Wan.
引文
[1]陈灏珠主编 实用内科学第10版 人民卫生出版社 1997，7：P1937
[2]沈迪，王辨明，宋善俊，等．临床血液学．北京：人民卫生出版社，1989．472～489
[3]天津市中医院血液组．六神丸治疗白血病10例临床疗效观察．天津医药，1976，(3)：135
[4]周蔼祥．青黄散治疗慢粒25例近期疗效观察．中西医结合杂志，1981，(1)：16
[5]黄世林．复方青黛片为主治疗APL的临床研究．中华血液学杂志，1995，(2)：26
[6]白月辉．雄黄对NB4及HL-60细胞的促凋亡作用．中华血液学杂志，1998，19(9)：477
[7]王振刚．雷公藤多甙诱导人前骨髓白血病细胞的凋亡．中华微生物学和免疫学杂志，2000，20(2)：123～125
[8]徐瑞成．蟾酥灵对HL-60细胞的生长抑制及凋亡诱导作用．中华血液学杂志，2000，21(7)：359～361
[9]徐芳．六神丸诱导白血病细胞凋亡及调控凋亡相关基因分子机制的实验研究．天津中医学院九八级博士论文．1998，7
[10]刘海涛 六神丸对白血病细胞凋亡的影响——体外实验 天津中医学院96级硕士研究生学位论文 1999．5
[11]司徒镇强，吴军正主编．细胞培养 世界图书出版公司，2000，4：186～187
[12]赵红卫，寿好长，闫福岭主编．细胞凋亡．河南医科大学出版社．1997，1：229～230
[13]韩锐 抗癌药物研究与实验技术 北京医科大学中国协和医科大学联合出版社 1997，4：284～286
[14]李莉 孔宪涛 细胞凋亡检测方法评价 上海医学检验杂志，2000，15(1)：57-59
[15]徐瑞成 陈小义 四种检测细胞凋亡方法的比较 武警医学院学报，2000，9(1)：17-20
[16]谭晓华 张亚历 细胞凋亡的方法学研究进展 肿瘤，1997，17(5)：288-291
[17]徐瑶 小柴胡汤对小鼠腹腔巨噬细胞释放NO的影响 中药新药与临床药理，2000，5(11)：289～290
[18]李仪奎 中药血清药理学实验方法的若干问题 中药新药与临床药理，1999，10(2)：95～98
[19]王宁生 关于血清药理学的若干思考 中国中西医结合杂志，1999，19(5)：263
[20]陈奇 中药药理研究方法学 北京 人民卫生出版社 1996年8月第1版：176～177
[21]田文艺 药物动力学参数手册[M] 长沙 湖南科技出版社，1987：5
[22]邓成珊，周蔼祥 当代中西医结合血液病学 北京 中国医药科技出版社 1997：137～138
[23]张洪钧、尚雪利、孙颖利，等 急性白血病易患体质研究及病因病机探讨 北京中医药大学学报，2002，25(1)：46～50
[24]苏伟、李伟 急性白血病中医证候分型与P170表达及临床疗效关系的研究 北京中医药大学学报，2001，24(2)：55～57
[25]刘秀文 六神丸并HOAP方案治疗急非淋21例 临床医学，1986，(3)：146
[26]唐由君 六神丸抗急性白血病复发 中医杂志，1993，(2)：110
[27]戴锡孟，杨学爽，杨文华，等 中医药治疗白血病的临床及实验研究，89
[28]Hashimoto S, Jing Y, Kawazoe N, et al Bufalin reduces the level of toposomerase Ⅱ in human leukemia HL-60 cells and affects the cytotoxicity of anti-cancer drugs Leuk Res ,1997,21:875～883
[29]刘延方、江滨、陆道培 硫化砷诱导NB4细胞凋亡及细胞周期阻滞的研究 中华血液学杂志，2000，21(12)：647～648
[30]钟璐 陈芳源 雄黄对NB4和HL-60细胞的形态，PMLMRNA及蛋白的表达影响 中国实验血液学杂志 2001，9(3)：223～227
[31]董倩，陈泽涛 流式细胞仪检测清开灵注射液及其有效成分诱导HL-60细胞凋亡及其机理研究 中国实验方剂学杂志，2000，6(6)：37～39
[2]沈迪，王辨明，宋善俊，等．临床血液学．北京：人民卫生出版社，1989．472～489
[3]天津市中医院血液组．六神丸治疗白血病10例临床疗效观察．天津医药，1976，(3)：135
[4]周蔼祥．青黄散治疗慢粒25例近期疗效观察．中西医结合杂志，1981，(1)：16
[5]黄世林．复方青黛片为主治疗APL的临床研究．中华血液学杂志，1995，(2)：26
[6]白月辉．雄黄对NB4及HL-60细胞的促凋亡作用．中华血液学杂志，1998，19(9)：477
[7]王振刚．雷公藤多甙诱导人前骨髓白血病细胞的凋亡．中华微生物学和免疫学杂志，2000，20(2)：123～125
[8]徐瑞成．蟾酥灵对HL-60细胞的生长抑制及凋亡诱导作用．中华血液学杂志，2000，21(7)：359～361
[9]徐芳．六神丸诱导白血病细胞凋亡及调控凋亡相关基因分子机制的实验研究．天津中医学院九八级博士论文．1998，7
[10]刘海涛 六神丸对白血病细胞凋亡的影响——体外实验 天津中医学院96级硕士研究生学位论文 1999．5
[11]司徒镇强，吴军正主编．细胞培养 世界图书出版公司，2000，4：186～187
[12]赵红卫，寿好长，闫福岭主编．细胞凋亡．河南医科大学出版社．1997，1：229～230
[13]韩锐 抗癌药物研究与实验技术 北京医科大学中国协和医科大学联合出版社 1997，4：284～286
[14]李莉 孔宪涛 细胞凋亡检测方法评价 上海医学检验杂志，2000，15(1)：57-59
[15]徐瑞成 陈小义 四种检测细胞凋亡方法的比较 武警医学院学报，2000，9(1)：17-20
[16]谭晓华 张亚历 细胞凋亡的方法学研究进展 肿瘤，1997，17(5)：288-291
[17]徐瑶 小柴胡汤对小鼠腹腔巨噬细胞释放NO的影响 中药新药与临床药理，2000，5(11)：289～290
[18]李仪奎 中药血清药理学实验方法的若干问题 中药新药与临床药理，1999，10(2)：95～98
[19]王宁生 关于血清药理学的若干思考 中国中西医结合杂志，1999，19(5)：263
[20]陈奇 中药药理研究方法学 北京 人民卫生出版社 1996年8月第1版：176～177
[21]田文艺 药物动力学参数手册[M] 长沙 湖南科技出版社，1987：5
[22]邓成珊，周蔼祥 当代中西医结合血液病学 北京 中国医药科技出版社 1997：137～138
[23]张洪钧、尚雪利、孙颖利，等 急性白血病易患体质研究及病因病机探讨 北京中医药大学学报，2002，25(1)：46～50
[24]苏伟、李伟 急性白血病中医证候分型与P170表达及临床疗效关系的研究 北京中医药大学学报，2001，24(2)：55～57
[25]刘秀文 六神丸并HOAP方案治疗急非淋21例 临床医学，1986，(3)：146
[26]唐由君 六神丸抗急性白血病复发 中医杂志，1993，(2)：110
[27]戴锡孟，杨学爽，杨文华，等 中医药治疗白血病的临床及实验研究，89
[28]Hashimoto S, Jing Y, Kawazoe N, et al Bufalin reduces the level of toposomerase Ⅱ in human leukemia HL-60 cells and affects the cytotoxicity of anti-cancer drugs Leuk Res ,1997,21:875～883
[29]刘延方、江滨、陆道培 硫化砷诱导NB4细胞凋亡及细胞周期阻滞的研究 中华血液学杂志，2000，21(12)：647～648
[30]钟璐 陈芳源 雄黄对NB4和HL-60细胞的形态，PMLMRNA及蛋白的表达影响 中国实验血液学杂志 2001，9(3)：223～227
[31]董倩，陈泽涛 流式细胞仪检测清开灵注射液及其有效成分诱导HL-60细胞凋亡及其机理研究 中国实验方剂学杂志，2000，6(6)：37～39