鸭疫里默氏杆菌和鸭源致病性大肠杆菌及鸭沙门氏菌的RAPD研究
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摘要
本研究采用随机扩增多态性DNA(RAPD)技术，利用20条随机引物对血清1型、血清2型、血清4型和血清5型的4株鸭疫里默氏杆菌(Riemerella Ahatipestifer)、5株5个血清型(O_1、O_2、O_5、O_(78)、O_(128))的鸭源致病性大肠杆菌(pathogenic Escherichia coli)和5株同一血清型的鸭沙门氏菌(salmonella)进行RAPD分析。从20条引物中选择8条引物并对其扩增图谱进行多态性分析和聚类分析；进一步又在8条引物中筛选一条具有种间鉴别力的引物，进行单一模板的多态性分析，寻找三种菌的特征性条带；再利用此引物进行混合模板的扩增，验证此特征性条带的稳定性和可重复性。结果如下：
(1)随机引物的筛选：这20个引物可分为①无扩增产物的引物G-01、G-20；②扩增产物无多态性的引物G-04、G-05、G-08、G-09、G-10、G-13、G-14、G-15、G-17和G-19；③扩增产物多态性较丰富的引物G-02、G-03、G-06、G-07、G-11、G-16和G-18；④具有种间鉴别力的引物G-12。
(2)扩增结果：所有扩增出的片段分子量在0.2-3.2kb之间。随机引物扩增出的条带数在5-16条之间，共扩增出102个条带，品种间相同的条带有1个，多态性条带有101个，多态性条带占99％。
(3)8条引物进行的聚类分析结果符合传统的分类：沙门氏菌与大肠杆菌的遗传距离较近，在相似性系数为0.725时聚在一起；鸭疫里默氏杆菌与大肠杆菌、沙门氏菌遗传距离相对较远，在相似性系数为0.54时，三者相聚。
(4)具有种间鉴别力的引物G-12的多态性分析得出RA、E.coli、Sal．的种特异性标记分别为535bp、1227bp和330bp。
(5)引物G-12的混合模板扩增仍能得到特征性标记。
本研究是第一次使用RAPD技术对鸭疫里默氏杆菌、鸭源致病性大肠杆菌、鸭沙门氏菌进行多态性分析，该方法具有快速、简单、准确的优点。
The random amplified polymorphic DNA (RAPD), was used in this paper to study the genetic diversity among four different serology Riemerella Anatipestifer (RA) and five pathogenic Escherichia coli and five salmonella from ducks. 8 primers were selected from twenty 10 bp arbitrary primers, and their amplification products were analyzed by cluster analysis. Then 1 primer was selected from above eight primers, which has authentication among interspecies, searching the characteristic bands.
The results showed that:
(1)These arbitrary primers could be divided into four groups, ﹏o amplification products, for example G-OK G-20; (2)no polymorphisms between amplification products, for example G-04, G-05, G-08, G-09, G-10, G-13, G-14, G-15, G-17, G-19; (Damplif ication products have enough polymorphisms, for example G-02, G-03, G-06, G-07, G-ll, G-12, G-16; ヾistinguish between interspecific, for example G~12.
(2)The length of all amplification products are between 0.2- 3.2kb. the number of amplification bands are between 5-16. Totally 102 RAPD bands were identified, of which, 1 band were commom in all the accessions and 101 bands were polymorphic between any two accessions. The polymorphic bands accounted for 99% of the total amplified bands.
(3)Cluster analysis were conducted for amplification products of eight primers, and the results accorded with traditional classification, that was the genetic distance matri between Escherichia coli and salmonella is closer, but the genetic distance matri between RA and Escherichia coli and salmonella is far.
(4)The differential sign bands among RA and Escherichia coli and salmonella are 535bp, 1227bp and 330bp.
(5)The differential sign bands were obtained when amplified with primer G-12 as mix-template.
This search is first time to study polymorphisms among RA and Escherichia coli and salmonella by RAPD. The RAPD has the advantages of simple, quick, accurate and stable.
(1)随机引物的筛选：这20个引物可分为①无扩增产物的引物G-01、G-20；②扩增产物无多态性的引物G-04、G-05、G-08、G-09、G-10、G-13、G-14、G-15、G-17和G-19；③扩增产物多态性较丰富的引物G-02、G-03、G-06、G-07、G-11、G-16和G-18；④具有种间鉴别力的引物G-12。
(2)扩增结果：所有扩增出的片段分子量在0.2-3.2kb之间。随机引物扩增出的条带数在5-16条之间，共扩增出102个条带，品种间相同的条带有1个，多态性条带有101个，多态性条带占99％。
(3)8条引物进行的聚类分析结果符合传统的分类：沙门氏菌与大肠杆菌的遗传距离较近，在相似性系数为0.725时聚在一起；鸭疫里默氏杆菌与大肠杆菌、沙门氏菌遗传距离相对较远，在相似性系数为0.54时，三者相聚。
(4)具有种间鉴别力的引物G-12的多态性分析得出RA、E.coli、Sal．的种特异性标记分别为535bp、1227bp和330bp。
(5)引物G-12的混合模板扩增仍能得到特征性标记。
本研究是第一次使用RAPD技术对鸭疫里默氏杆菌、鸭源致病性大肠杆菌、鸭沙门氏菌进行多态性分析，该方法具有快速、简单、准确的优点。
The random amplified polymorphic DNA (RAPD), was used in this paper to study the genetic diversity among four different serology Riemerella Anatipestifer (RA) and five pathogenic Escherichia coli and five salmonella from ducks. 8 primers were selected from twenty 10 bp arbitrary primers, and their amplification products were analyzed by cluster analysis. Then 1 primer was selected from above eight primers, which has authentication among interspecies, searching the characteristic bands.
The results showed that:
(1)These arbitrary primers could be divided into four groups, ﹏o amplification products, for example G-OK G-20; (2)no polymorphisms between amplification products, for example G-04, G-05, G-08, G-09, G-10, G-13, G-14, G-15, G-17, G-19; (Damplif ication products have enough polymorphisms, for example G-02, G-03, G-06, G-07, G-ll, G-12, G-16; ヾistinguish between interspecific, for example G~12.
(2)The length of all amplification products are between 0.2- 3.2kb. the number of amplification bands are between 5-16. Totally 102 RAPD bands were identified, of which, 1 band were commom in all the accessions and 101 bands were polymorphic between any two accessions. The polymorphic bands accounted for 99% of the total amplified bands.
(3)Cluster analysis were conducted for amplification products of eight primers, and the results accorded with traditional classification, that was the genetic distance matri between Escherichia coli and salmonella is closer, but the genetic distance matri between RA and Escherichia coli and salmonella is far.
(4)The differential sign bands among RA and Escherichia coli and salmonella are 535bp, 1227bp and 330bp.
(5)The differential sign bands were obtained when amplified with primer G-12 as mix-template.
This search is first time to study polymorphisms among RA and Escherichia coli and salmonella by RAPD. The RAPD has the advantages of simple, quick, accurate and stable.
引文
1 (美)B．W．卡尔尼克 主编，高福，苏敬良 主译．禽病学[M]，第十版．中国农业出版社，1999：195～202．
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