复方缬芎滴丸对心肌缺血保护作用及其机制探讨
摘要
复方缬芎滴丸(Valeriana officinalis L-Ligusticum chuanxiong Hort．Compound，VLC)，主要由缬草提取物(主要含有挥发油和环烯萜)和川芎提取物(主要含有挥发油、阿魏酸和川芎嗪)组成。有报道，缬草具有抗心肌缺血的作用；川芎嗪是川芎Ligusticum chuanxiong Hort．的一种有效成份，已用于脏器缺血再灌注损伤的防治。缬草和川芎嗪合用抗急性心肌缺血的效果如何，尚未见有关报道。本文观察了VLC对犬急性心肌缺血的保护作用；在建立心肌细胞缺氧再给氧模型的基础上，对其作用机制进行了探讨。
一、犬急性心肌缺血模型的建立
急性心肌缺血的造模方法主要有：(1)结扎冠状动脉：结扎冠状动脉左缘支或前降支，但动物死亡率高。(2)用栓子选择性造成冠状动脉栓塞，如用油质、石松子孢、汞，或用手术通过导管输入颗粒样或小球类异物，这种方法要求技术熟练，条件严格。(3)通电造成栓塞，或用药物造成冠状动脉内栓塞，但这种方法受多种条件限制，尚难推广使用。(4)采用冠状动脉狭窄器与电磁流量计的联合应用，以达到不同狭窄下冠状动脉流量的变化。在上述方法中，结扎冠状动脉法最为常用，其关键是结扎部位的确定。文献报道中结扎部位主要有以下两种：1、结扎左冠状动脉主干刚分出第一斜角支处；2、结扎左冠状动脉前降支中下1／3处。本文通过实验发现，结扎左冠状动脉前降支中下1／3处，梗死面积不确切，甚至无明显梗死，动物死亡率高。为此，我们采用结扎犬左冠状动脉左缘支及对角支中点的方法制作心肌缺血模型。结果显示，此方法远较上述方法为优，动物死亡率较低，且梗死面积小而确切。
二、VLC对犬急性心肌缺血的保护作用
采用结扎犬左冠状动脉左缘支及对角支中点，建立急性心肌缺血模型。以心外膜心电图中ST段升高总毫伏数(∑ST)、升高超过2mv的导联数(NST)、病理性Q波数(NQ)、心肌酶学及心肌梗死指数为检测指标，观察VLC对犬急性心肌缺血的保护作用，并同时观察其对动物呼吸、血压的影响。与对照组相比，VLC 8.15mg／kg剂量组∑ST(6h)、NST(6h)、NQ(6h)、NQ(18h)分别较对照组下降67％、52％
、61%、47%(P<0 .05);vLc 32.5mg/kg剂量组上述各指标分别下降“%、52%、58%
、47%(P<0.05);阳性对照药Danshen上述指标分别下降74%、63%、71%、70%
(P<0 .05)。血清磷酸激酶(C PK)值:各组结扎前均无明显差异，18h时，8.15mg/kg、
32.5mg/kg两剂量组较模型组分别下降74%、57%(P<0.05)，Danshen组较模型组下
降35%(P<0.05);血清乳酸脱氢酶(L DH)值两组较模型组分别降低45%、43%
(P<0.05)，Danshen组较模型组下降540，0(P<0.05)。心肌梗死指数:8.15mg/kg、
32.5mg/kg两剂量组较模型组分别下降61%、56%(P<0.05)，Danshen组较模型组下
降62%(P<0.05)。结果表明，VLC能够明显降低急性心肌梗死中CPK、LDH含量，
减小心肌梗死面积，与Danshen相比，呈现相似的药理作用。大剂量组尚能够减慢心
肌梗死后的心率加快，对心脏起保护作用。
三、VLC对急性心肌缺血保护作用机制的探讨
离体实验方法对于中药而言，存在着一定程度的困难。由于中药粗制剂含大量杂
质，直接加入离体实验系统，将对实验结果产生影响。近年来发展的中药血清药理学方
法是一种新的实验方法。在整体动物给药的基础上，通过分离受试动物血清，加至离
体反应系统进行实验，以观察药物效应。
为了从细胞水平对VLC的作用机制进行探讨，本文采用了血清药理学的研究方
法。对大鼠进行灌胃给予VLC，剂量分别为32mg服g、16mg/kg，空白组给予等体积生
理盐水;制备含药血清。将含药血清加入培养5天的乳鼠心肌细胞中，阳性组直接加
入川芍嗦。厌氧培养24小时后，更换培养基(含有受试药)，再给氧4小时。阴性对
照组一直置于常规下培养。最后，检测培养基上清中LDH及细胞中MDA含量。消化
受试乳鼠心肌细胞制成细胞悬液，进行碘化丙陡(PI)染色，用流式细胞仪检测心肌细胞
凋亡百分率。结果显示，与正常组相比，缺氧再给氧损伤组LDH、MDA含量分别增
高164%、749%(P<0.01)，说明细胞在缺氧再给氧后脂质过氧化增强，心肌细胞出
现明显的损伤。与模型组相比，VLC 32mg/Kg含药血清组LDH、MDA值分别降低26%
、38%(P<0.01);VLC 16mg/Kg含药血清组LDH、MDA值分别降低50%、68%(P
<0.01)，表明VLC有抗心肌细胞脂质过氧化的作用。流式细胞仪检测结果如下:与
模型组相比，VLC 32mg/Kg、1 6mg/Kg含药血清组心肌细胞凋亡率分别降低38%、69%
(P<0.01)，表明VLC可降低缺氧再给氧后心肌细胞凋亡百分率。
综上所述，VLC对急性心肌缺血有明显的保护作用。其作用机制可能是，VLC能
够降低心肌缺血时氧自由基的产生，并有抗心肌细胞凋亡的作用。
In this paper,protective effect of VLC on myocardial ischemia was investigated.After establishing a hypoxia-reoxygenation model on neonatal rat myocytes,we investigated the machanism of its protective effect. l.The establishment of acute myocardial ischemia model on dogs
From the literature,two methods were used in establishing myocardial ischemia models: (1) the left anterior descending artery (LAD) occlusion was employed proximal to the first diagonal branch;(2)Left anterior descending artery(LAD) occlusion were employed under the middle point.In the above method,the ischemia area was large and the motality was high.Therefore,the left marginal branch and diagonal branch occlusion were employed in our method.Conclusion: the method we used was much better. 2.The protective effect of VLC on acute myocardial ischemia on dogs
Establish an acute myocardial ischemia model on dogs,then left marginal branch and diagonal branch of left anterior descending artery(LAD) occlusion were employed in this study.The total elevating millivolts of ST (Σ ST) ,the leads number that ST elevating over 2 millivolts (NST) ,the number of pathological Q waves(NQ) on epicardial ECG;the contents of LDH, CPK in serum and the infarction index were observed to evaluate the protective effect of VLC;at the same time,heart rate and blood pressure were measured.Compared with control group,VLC decreased the ΣST, NST, NQ values on epicardial ECG, GPT, AKP content in serum .Simultaneously,the high dose group could decrease heart rate after ischemia.lt suggested that VLC had protective effect on myocardial ischemia. 3.The mechanism research of VLC on acute myocardial ischemia
Serum pharmacology method were used in this study.After 5 days treatment with VLC 32mg/Kg , 16mg/Kg ig. in rats,the serum were separated and added into culture medium.Then,the myocardial cells of neonatal rats were cultured under hypoxia condition for 24h,followed by reoxygenation for 4 h.Finally ,the LDH and MDA were examined.To get the apoptosis rate,the FCM were used.VLC has anti-apoptosis effect in myocardial cells by decreasing the production of ROS.
一、犬急性心肌缺血模型的建立
急性心肌缺血的造模方法主要有：(1)结扎冠状动脉：结扎冠状动脉左缘支或前降支，但动物死亡率高。(2)用栓子选择性造成冠状动脉栓塞，如用油质、石松子孢、汞，或用手术通过导管输入颗粒样或小球类异物，这种方法要求技术熟练，条件严格。(3)通电造成栓塞，或用药物造成冠状动脉内栓塞，但这种方法受多种条件限制，尚难推广使用。(4)采用冠状动脉狭窄器与电磁流量计的联合应用，以达到不同狭窄下冠状动脉流量的变化。在上述方法中，结扎冠状动脉法最为常用，其关键是结扎部位的确定。文献报道中结扎部位主要有以下两种：1、结扎左冠状动脉主干刚分出第一斜角支处；2、结扎左冠状动脉前降支中下1／3处。本文通过实验发现，结扎左冠状动脉前降支中下1／3处，梗死面积不确切，甚至无明显梗死，动物死亡率高。为此，我们采用结扎犬左冠状动脉左缘支及对角支中点的方法制作心肌缺血模型。结果显示，此方法远较上述方法为优，动物死亡率较低，且梗死面积小而确切。
二、VLC对犬急性心肌缺血的保护作用
采用结扎犬左冠状动脉左缘支及对角支中点，建立急性心肌缺血模型。以心外膜心电图中ST段升高总毫伏数(∑ST)、升高超过2mv的导联数(NST)、病理性Q波数(NQ)、心肌酶学及心肌梗死指数为检测指标，观察VLC对犬急性心肌缺血的保护作用，并同时观察其对动物呼吸、血压的影响。与对照组相比，VLC 8.15mg／kg剂量组∑ST(6h)、NST(6h)、NQ(6h)、NQ(18h)分别较对照组下降67％、52％
、61%、47%(P<0 .05);vLc 32.5mg/kg剂量组上述各指标分别下降“%、52%、58%
、47%(P<0.05);阳性对照药Danshen上述指标分别下降74%、63%、71%、70%
(P<0 .05)。血清磷酸激酶(C PK)值:各组结扎前均无明显差异，18h时，8.15mg/kg、
32.5mg/kg两剂量组较模型组分别下降74%、57%(P<0.05)，Danshen组较模型组下
降35%(P<0.05);血清乳酸脱氢酶(L DH)值两组较模型组分别降低45%、43%
(P<0.05)，Danshen组较模型组下降540，0(P<0.05)。心肌梗死指数:8.15mg/kg、
32.5mg/kg两剂量组较模型组分别下降61%、56%(P<0.05)，Danshen组较模型组下
降62%(P<0.05)。结果表明，VLC能够明显降低急性心肌梗死中CPK、LDH含量，
减小心肌梗死面积，与Danshen相比，呈现相似的药理作用。大剂量组尚能够减慢心
肌梗死后的心率加快，对心脏起保护作用。
三、VLC对急性心肌缺血保护作用机制的探讨
离体实验方法对于中药而言，存在着一定程度的困难。由于中药粗制剂含大量杂
质，直接加入离体实验系统，将对实验结果产生影响。近年来发展的中药血清药理学方
法是一种新的实验方法。在整体动物给药的基础上，通过分离受试动物血清，加至离
体反应系统进行实验，以观察药物效应。
为了从细胞水平对VLC的作用机制进行探讨，本文采用了血清药理学的研究方
法。对大鼠进行灌胃给予VLC，剂量分别为32mg服g、16mg/kg，空白组给予等体积生
理盐水;制备含药血清。将含药血清加入培养5天的乳鼠心肌细胞中，阳性组直接加
入川芍嗦。厌氧培养24小时后，更换培养基(含有受试药)，再给氧4小时。阴性对
照组一直置于常规下培养。最后，检测培养基上清中LDH及细胞中MDA含量。消化
受试乳鼠心肌细胞制成细胞悬液，进行碘化丙陡(PI)染色，用流式细胞仪检测心肌细胞
凋亡百分率。结果显示，与正常组相比，缺氧再给氧损伤组LDH、MDA含量分别增
高164%、749%(P<0.01)，说明细胞在缺氧再给氧后脂质过氧化增强，心肌细胞出
现明显的损伤。与模型组相比，VLC 32mg/Kg含药血清组LDH、MDA值分别降低26%
、38%(P<0.01);VLC 16mg/Kg含药血清组LDH、MDA值分别降低50%、68%(P
<0.01)，表明VLC有抗心肌细胞脂质过氧化的作用。流式细胞仪检测结果如下:与
模型组相比，VLC 32mg/Kg、1 6mg/Kg含药血清组心肌细胞凋亡率分别降低38%、69%
(P<0.01)，表明VLC可降低缺氧再给氧后心肌细胞凋亡百分率。
综上所述，VLC对急性心肌缺血有明显的保护作用。其作用机制可能是，VLC能
够降低心肌缺血时氧自由基的产生，并有抗心肌细胞凋亡的作用。
In this paper,protective effect of VLC on myocardial ischemia was investigated.After establishing a hypoxia-reoxygenation model on neonatal rat myocytes,we investigated the machanism of its protective effect. l.The establishment of acute myocardial ischemia model on dogs
From the literature,two methods were used in establishing myocardial ischemia models: (1) the left anterior descending artery (LAD) occlusion was employed proximal to the first diagonal branch;(2)Left anterior descending artery(LAD) occlusion were employed under the middle point.In the above method,the ischemia area was large and the motality was high.Therefore,the left marginal branch and diagonal branch occlusion were employed in our method.Conclusion: the method we used was much better. 2.The protective effect of VLC on acute myocardial ischemia on dogs
Establish an acute myocardial ischemia model on dogs,then left marginal branch and diagonal branch of left anterior descending artery(LAD) occlusion were employed in this study.The total elevating millivolts of ST (Σ ST) ,the leads number that ST elevating over 2 millivolts (NST) ,the number of pathological Q waves(NQ) on epicardial ECG;the contents of LDH, CPK in serum and the infarction index were observed to evaluate the protective effect of VLC;at the same time,heart rate and blood pressure were measured.Compared with control group,VLC decreased the ΣST, NST, NQ values on epicardial ECG, GPT, AKP content in serum .Simultaneously,the high dose group could decrease heart rate after ischemia.lt suggested that VLC had protective effect on myocardial ischemia. 3.The mechanism research of VLC on acute myocardial ischemia
Serum pharmacology method were used in this study.After 5 days treatment with VLC 32mg/Kg , 16mg/Kg ig. in rats,the serum were separated and added into culture medium.Then,the myocardial cells of neonatal rats were cultured under hypoxia condition for 24h,followed by reoxygenation for 4 h.Finally ,the LDH and MDA were examined.To get the apoptosis rate,the FCM were used.VLC has anti-apoptosis effect in myocardial cells by decreasing the production of ROS.
引文
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[3] 彭黎明，王曾礼，等．细胞凋亡的基础与临床(第1版)．人民卫生出版社，2001．
[4] 徐叔云，卞如廉，等．药理实验方法学(第三版)．北京，人民卫生出版社，2002．
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[7] Jian-Gang, Shen,Xing-Sheng Quo,Bo Jiang et al Chinonin, a novel drug agaist cardiomyocyte apoptosis induced by hypoxia and reoxygenation.Biochemia et Biophysica Acta 1500(2000) 217-226.
[8] 吴伟康，侯灿，罗汉川，等．四逆汤保护缺血心肌的实验研究．中国中西医结合杂志．1994，15(9)：549．
[9] 杨继声，卢兴，张万年，等．心肌梗塞后影响左心室功能因素的实验研究．中华心血管病杂志，1987，15(5)：294．
[10] 吴伟康，罗汉川，等．四逆汤清除氧自由基及抗心肌脂质过氧化反应的体外试验．中国中药杂志，1995，20(4)：235．
[11] 王跃民，臧益民，等．一种新的在体犬冠状动脉定量缺血模型．心脏杂志，2000，12(1)：20-22
[12] Luiz F Monteiro Barros,Antonio Carlos Palandri Chagas,Protasio Lemos da Luz, et al. Magnesium treatment of acute myocardial infarction: effects on necrosis in an occlusion/reperfusion dog model[J].International Joural of Cardiology, 1995(48), 3-9.
[13] 李川勇 贾林壮，等．表示心室复极不一致的有效参数的研究．生物医学工程学杂志，2001；18(4)：608-610．
[14] Anne Gysembergh,Robert A.Kloner, Karin Przyklenk.Pretreatment with the gap junction uncoupler heptanol does not limit infarct size in rabbit heart[J].Cardiovascular Pathology,2001; 10: 13-17.
[15] 张朝佑．人体解剖学[M] (第2版)．人民卫生出版社，1997．
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[18] 尹虹，薛存宽，叶建明，等．缬草提取物抗心肌缺血再灌注损伤的实验研究．2000，10(1)：12-14．
[19] 王磊，彭仁琇，杨静，等．复方缬芎滴丸对犬急性心肌缺血的保护作用．中草药，2004，35(3) 304-306．
[20] 郑凌云，周祖玉，等．黄连素对缺血再灌注心肌细胞损伤的保护作用．四川大学学报(医学版)2003，34(3)：452-454
[21] Tian-Li Yue,Xin-Liang Ma,Xinkang Wang.Stress-activated Protein Kinase Signaling pathway and Fas Receptor Expression in Prevention of Ischemia/Reperfusion-induced Cardiomyocyte Apoptosis by Carvedilol.Circulation Research,1998;82: 166.
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