杨树抗虫基因转化及抗虫性研究
|
摘要
为了有效解决杨树虫害问题和完善转抗虫基因植物培育技术体系，通过室内和
室外饲虫试验，研究了转基因杨树的抗虫性鉴定、抗虫效应及抗性规律；并应用基
因工程技术进行了青杨再生体系建立和双价抗虫基因的转化。
（1）转双价抗虫基因741毛白杨无性系对鳞翅目害虫的抗虫性生物测定。通过对
741毛白杨转基因无性系的抗虫性生物测定，将各无性系划分为高抗、中抗、低抗
和不抗四个等级，其中筛选出高抗和中抗无性系各3个。同时发现双价抗虫基因的
表达与气温变化密切相关。随着气温的逐渐下降，昆虫死亡率逐渐下降。试验结果
表明，各转基因无性系中昆虫的总死亡率、累计死亡率、各龄期死亡率与对照均存
在着显著差异，可以准确反映抗虫基因对昆虫的毒杀作用并体现出不同抗性无性系
杀虫特性的不同。试验还着力探讨了外源抗虫基因对测试昆虫的生长、发育的作用。
试验结果表明，转基因无性系对测试昆虫的生长发育有明显抑制作用。各转基因无
性系中蜕皮指数明显小于对照，昆虫各发育龄期历期比对照明显延长，各龄期发育
速率亦远远小于对照，显示出对昆虫发育的明显抑制作用。从昆虫体重增长速率及
蛹重来看，转基因无性系中昆虫体重增长速率比对照明显减慢，昆虫蛹重亦明显小
于对照，体现了转基因无性系对昆虫生长明显的抑制作用。同时筛选出了昆虫的蜕
皮指数、各发育龄期历期及各龄期发育速率、昆虫体重增长速率及蛹重等指标来全
面而准确地反映转基因无性系对昆虫生长、发育的抑制作用。对各种昆虫的累计死
亡率及各龄期死亡率分析结果表明，不同昆虫种类和同一昆虫幼虫的不同龄级对转
基因无性系的敏感性亦有显著差异。4种昆虫的敏感性强弱依次为：美国白蛾＞杨
小舟蛾＞杨扇舟蛾＞舞毒蛾。随着昆虫幼虫龄级的增加，对转基因无性系的敏感性
逐渐降低。确定了以网袋为器皿的最佳的田间群体试验方法，使试验在与生态环境
基本一致的情况下进行，提高了试验结果的准确性。
（2）转Bt基因和转凝集素基因的741毛白杨无性系对桑天牛抗性的确定。利用
树上套笼接虫试验方法，测定了741毛白杨18个转基因无性系对桑天牛的抗性，通
过聚类分析及对各危害指标的观察比较，初步确定了P10、CC11、CC25、CC53等
4个抗天牛的无性系和1个轻感天牛的无性系P22。
（3）青杨再生体系的建立及双价抗虫基因的转化。建立了青杨的最佳再生体系，
即以叶片为外植体，诱导体胚或不定芽再生的培养基为1/2MS+6-BA0.3+IBA0.05或
MS＋6－BA．0＋IBAO刀5＋NAAO．05，进行芽增殖的培养基为 MS＋6．BAO．5＋旧AO．25，
诱导嫩茎生根的培养基为1／2MS＋IBAO．3。并初步确定了适于青杨的遗传转化系统，
巨口：
fitftff Zd 共培养 3d
带切口的叶片外植体 一一一一一一卜感染细菌的叶片一二二7和 共培养叶片
暗培养
含Km50m。L的 含Km80m。L的 含Km80m少L的
一一一一一一一一和小定牙 一一一一一一一和孤性牙 一一一一一一一争
选择培养杜 选择培养基 生根培养基
完整的转基冈植株
（4）双价抗虫基冈对青杨和雄性毛白杨的转化试验。通过对青杨和雄性毛白杨进
行状价抗虫基冈的转化试验，经含 Km 40ngiL的生根培养基的筛选，获得了青杨抗
性植株旧株，雄性毛白杨抗性植株门株。这是初步确定的转基因植株。
To solve the problems of poplar pestis efficiently and perfect the education
system of transformed plants with insect-resistant gene, studies were conducted on the
insect-resistance, resistant effect and resistant regularity of the transformed plants of
poplar by testing 5 species of insect indoors and outdoors. Experiments, at the same time,
were done on Populus cathayana to set up its regenerative system and transform it with
divalent insect-resistant genes using genetic engineering technology.
(1) Test on insect-resistance of Lepfdopteran of transgenic clones ( hybrid poplar 741)
transformed with the divalent insect-resistant genes According to the testing on their
insect-resistance, the transformed clones of hybird poplar 741 were compartmentalized to
4 grades: high insect-resistance, middling insect-resistance, low insect-resistance and no
insect-resistance of which 3 high inscet-resistance clones and 3 middling insect-resistance
clones were suggested. At the same time, it was found that the insect-resistance of the
transformed plants was intimatly correlated with the variation of the temperature which
was embodied by the dropping of the insect mortality with the temperature dropping. It
was indicated by the results of the experiment that the insect total mortality, cumulative
mortality, mortality of every stadium of the transformed clones which were significantly
different form the control plants could image the poison of the insect-resistant gene on the
insects and embody the different pesticidal activity of different clones. In addition,
experiments were done on the insects to approach the effect of the insect-resistant gene on
the insect growth and development. The results indicated that the transformed clones
inhibited the insects growth and development significantly. The ecdysis exponentials of
transformed clones were obviously less than CK. The auxetic duration was obviously
delayed and the rate of every stadium was obviously less than CK which embodied the
inhibit effect on the insects?development. Form the growth rate of larva weight and the
pupa weight, it could be seen that the growth rate of larva weight who fetched the
transformed clones was slower than CK and the pupa weight was also lighter than CK
which embodied the inhibit effect of the transformed clones on the insects. The ecdysis
exponential, the auxetic duration and the rate of every stadium and the growth rate of
insect and the pupa weight, at the same time, were selected which could image the inhibit
effect of the transformed clones on the insects growth and development accurately and
all-sidedly. By analysising the insects cumulative mortality and mortality of every
stadium, it was found that there were obviously differences in the sensitivity of different
species of insect and different stadium of the same insects larvas. The sequence of the 4
insects sensitivity was Hyphanfria cunea (Drury) Micromelaopha troglodyta (Graeser
Clostera anachoreta (Fabricius)> Lymantria dispar (Linnaeus). The higher the stadium of
the insect larva, the lower the sensitivity on the transformed clones. A good method of
field colonial test using web sack was selected that can raise the accuracy of testing
results because of it being with the similar surrounding as ecotop. A convenient and
available test method, used aqua cultural wattles indoors was provideded for Hyphantria
cunea (Drury).
(2) Field test on the resistance of transgenic clones ( hybrid poplar 741 ) transformed with
Bt-toxin gene and Lectin gene on Apriona german (Hope) By using the method of
inoculating insects i
室外饲虫试验，研究了转基因杨树的抗虫性鉴定、抗虫效应及抗性规律；并应用基
因工程技术进行了青杨再生体系建立和双价抗虫基因的转化。
（1）转双价抗虫基因741毛白杨无性系对鳞翅目害虫的抗虫性生物测定。通过对
741毛白杨转基因无性系的抗虫性生物测定，将各无性系划分为高抗、中抗、低抗
和不抗四个等级，其中筛选出高抗和中抗无性系各3个。同时发现双价抗虫基因的
表达与气温变化密切相关。随着气温的逐渐下降，昆虫死亡率逐渐下降。试验结果
表明，各转基因无性系中昆虫的总死亡率、累计死亡率、各龄期死亡率与对照均存
在着显著差异，可以准确反映抗虫基因对昆虫的毒杀作用并体现出不同抗性无性系
杀虫特性的不同。试验还着力探讨了外源抗虫基因对测试昆虫的生长、发育的作用。
试验结果表明，转基因无性系对测试昆虫的生长发育有明显抑制作用。各转基因无
性系中蜕皮指数明显小于对照，昆虫各发育龄期历期比对照明显延长，各龄期发育
速率亦远远小于对照，显示出对昆虫发育的明显抑制作用。从昆虫体重增长速率及
蛹重来看，转基因无性系中昆虫体重增长速率比对照明显减慢，昆虫蛹重亦明显小
于对照，体现了转基因无性系对昆虫生长明显的抑制作用。同时筛选出了昆虫的蜕
皮指数、各发育龄期历期及各龄期发育速率、昆虫体重增长速率及蛹重等指标来全
面而准确地反映转基因无性系对昆虫生长、发育的抑制作用。对各种昆虫的累计死
亡率及各龄期死亡率分析结果表明，不同昆虫种类和同一昆虫幼虫的不同龄级对转
基因无性系的敏感性亦有显著差异。4种昆虫的敏感性强弱依次为：美国白蛾＞杨
小舟蛾＞杨扇舟蛾＞舞毒蛾。随着昆虫幼虫龄级的增加，对转基因无性系的敏感性
逐渐降低。确定了以网袋为器皿的最佳的田间群体试验方法，使试验在与生态环境
基本一致的情况下进行，提高了试验结果的准确性。
（2）转Bt基因和转凝集素基因的741毛白杨无性系对桑天牛抗性的确定。利用
树上套笼接虫试验方法，测定了741毛白杨18个转基因无性系对桑天牛的抗性，通
过聚类分析及对各危害指标的观察比较，初步确定了P10、CC11、CC25、CC53等
4个抗天牛的无性系和1个轻感天牛的无性系P22。
（3）青杨再生体系的建立及双价抗虫基因的转化。建立了青杨的最佳再生体系，
即以叶片为外植体，诱导体胚或不定芽再生的培养基为1/2MS+6-BA0.3+IBA0.05或
MS＋6－BA．0＋IBAO刀5＋NAAO．05，进行芽增殖的培养基为 MS＋6．BAO．5＋旧AO．25，
诱导嫩茎生根的培养基为1／2MS＋IBAO．3。并初步确定了适于青杨的遗传转化系统，
巨口：
fitftff Zd 共培养 3d
带切口的叶片外植体 一一一一一一卜感染细菌的叶片一二二7和 共培养叶片
暗培养
含Km50m。L的 含Km80m。L的 含Km80m少L的
一一一一一一一一和小定牙 一一一一一一一和孤性牙 一一一一一一一争
选择培养杜 选择培养基 生根培养基
完整的转基冈植株
（4）双价抗虫基冈对青杨和雄性毛白杨的转化试验。通过对青杨和雄性毛白杨进
行状价抗虫基冈的转化试验，经含 Km 40ngiL的生根培养基的筛选，获得了青杨抗
性植株旧株，雄性毛白杨抗性植株门株。这是初步确定的转基因植株。
To solve the problems of poplar pestis efficiently and perfect the education
system of transformed plants with insect-resistant gene, studies were conducted on the
insect-resistance, resistant effect and resistant regularity of the transformed plants of
poplar by testing 5 species of insect indoors and outdoors. Experiments, at the same time,
were done on Populus cathayana to set up its regenerative system and transform it with
divalent insect-resistant genes using genetic engineering technology.
(1) Test on insect-resistance of Lepfdopteran of transgenic clones ( hybrid poplar 741)
transformed with the divalent insect-resistant genes According to the testing on their
insect-resistance, the transformed clones of hybird poplar 741 were compartmentalized to
4 grades: high insect-resistance, middling insect-resistance, low insect-resistance and no
insect-resistance of which 3 high inscet-resistance clones and 3 middling insect-resistance
clones were suggested. At the same time, it was found that the insect-resistance of the
transformed plants was intimatly correlated with the variation of the temperature which
was embodied by the dropping of the insect mortality with the temperature dropping. It
was indicated by the results of the experiment that the insect total mortality, cumulative
mortality, mortality of every stadium of the transformed clones which were significantly
different form the control plants could image the poison of the insect-resistant gene on the
insects and embody the different pesticidal activity of different clones. In addition,
experiments were done on the insects to approach the effect of the insect-resistant gene on
the insect growth and development. The results indicated that the transformed clones
inhibited the insects growth and development significantly. The ecdysis exponentials of
transformed clones were obviously less than CK. The auxetic duration was obviously
delayed and the rate of every stadium was obviously less than CK which embodied the
inhibit effect on the insects?development. Form the growth rate of larva weight and the
pupa weight, it could be seen that the growth rate of larva weight who fetched the
transformed clones was slower than CK and the pupa weight was also lighter than CK
which embodied the inhibit effect of the transformed clones on the insects. The ecdysis
exponential, the auxetic duration and the rate of every stadium and the growth rate of
insect and the pupa weight, at the same time, were selected which could image the inhibit
effect of the transformed clones on the insects growth and development accurately and
all-sidedly. By analysising the insects cumulative mortality and mortality of every
stadium, it was found that there were obviously differences in the sensitivity of different
species of insect and different stadium of the same insects larvas. The sequence of the 4
insects sensitivity was Hyphanfria cunea (Drury) Micromelaopha troglodyta (Graeser
Clostera anachoreta (Fabricius)> Lymantria dispar (Linnaeus). The higher the stadium of
the insect larva, the lower the sensitivity on the transformed clones. A good method of
field colonial test using web sack was selected that can raise the accuracy of testing
results because of it being with the similar surrounding as ecotop. A convenient and
available test method, used aqua cultural wattles indoors was provideded for Hyphantria
cunea (Drury).
(2) Field test on the resistance of transgenic clones ( hybrid poplar 741 ) transformed with
Bt-toxin gene and Lectin gene on Apriona german (Hope) By using the method of
inoculating insects i
引文
[1] 贾士荣．转基因植物的环境及食品安全性[J]．生物工程进展，1997，17(6) ： 37～42．
[2] 贾士荣．转基因植物食品中标记基因的安全性评价[J]．中国农业科学，1997，30 (2) ：1～15．
[3] Knight P J K，Crichmore N，et al．The receptor for Bacillus thuringiensis CrylA(c) delta-endotoxin in the brush border membrane of the Lepidopteram Manduca sexta is aminopeptiase N[J]．Mol Microbiol，1994，11：429～430．
[4] Sangadala S，Walters F S，et al．A mixture of Manduca sexta aminopeptidase and phosphatase enhances Bacillus thuringiensis insecticidal CrylA(c) toxin binding and 86Rb+-K+ offlux in vitro[J]．J．Biol Chem，1994，269/10088～10092．
[5] Vadlarnudi R K，Weber E，et al．Cloning and expression of a receptor for an insecticidal toxin of Bacillus thuringiensis[J]．J．Biol Chem，1995，270：5490～5494．
[6] 朱新生，朱玉贤．抗虫植物基因工程研究进展[J]．植物学报，1997，39(3) ： 282～288．
[7] 谢先芝．抗虫转基因植物的研究进展及前景[J]．生物工程进展，1999，19(6) ： 47～51．
[8] 周兆斓，朱祯．植物抗虫基因工程研究进展[J]．生物工程进展，1994，14：18～24．
[9] 毛立群，郭三堆．Genetic engineering on insect-specific neurotoxins：present and future[J]．生物技术通报，1998,6：1～6．
[10] Vardi A，Bleichmans，Aviv D．Genetic transformation of transgenic plant[J]．Plant Science，1990，69：199～206．
[11] 王善平，许农，许智宏，等．利用PEG法对Gus基因在儿种杨树原生质体中瞬间 表达的研究[J]．实验生物学报，1991，24(1) ：71～73．
[12] 朱至清．植物体细胞无性繁殖与改良育种[M]．陈英 主编．江苏科学出版社， 1990：1～7．
[13] 贾敬芬．植物原生质体培养[M]．北京：科学出版社，1990：15～16．
[14] 林万明．核酸探针杂交实验技术[M]．中国科学技术出版社，1991．
[15] 谢友菊．遗传工程概论[M]．北京农业大学出版社，1992．
[16] 田颖川，韩一凡，李太元，等．抗虫转基因欧洲黑杨的培育[J]．生物工程学报， 1993，9(4) ：291～297．
[17] Karl W K，David D E，et al．Field evalumion of transgenic poplar expressing a
Bacillus thuringiensis CrylA(a) d-Endotoxin gene against forest tent caterpillar (Lepidoptera：Lecsiocampidae)and gypsy moth(L:Lymantriidae)following winter dormancy[J]．Environ．Entomol，1995，24(5) ：1358～1364．
[18] 胡廷章,徐云剑，江国英,等．转 BmK IT4基因烟草的抗虫性[J]．植物学报， 2000，42(7) ：732～735．
[19] Mcnabb．H S，et al．A field trial of transgenic hybrid poplar trees：establishment and growth through the second season[J]．Agroculture Resarch Institute，1991：155～159．
[20] Klopeensten N B，et al．Transgenic Populus hybrid express a wound-inducible potato proteinase inhibitor Ⅱ-CAT fusion[J]．Can．J．Forest．Res，199l，21：1321～1328．
[21] Klopeensten，N B，et al．Transformation of Populus hybrids to study and improve pest resistance[J]．Silvae Genetica,1993，42(2-3) ：86～90．
[22] Howe G T, Goldfarb B，et al．Agrobacterium-mediated transformation of hybrid poplar suspension cultures and regeneration of transformed plants[J]．Plant cell， Tissue and Organ Culture，1994，36：59～71．
[23] Leple J C，Brasileiro A C M．Transgenic poplars：expression of chimeric genes using four different constructs[J]．Michel．plant cell Reports，1992，11：137～141．
[24] Leple J C，et al．Transgenic poplars：expression of chimeric genes using four different constructs[J]．Plant Cell Report，1992，11：173～181．
[25] Ann，S M．Science，1996，271(9) ：670～671．
[26] Confalonieri M，Allegro G，Balestrazzi A et al．Regeneration of Populus nigra transgenic plants expressing a Kunitz proteinase inhibitor(Kti 3) gene[J]．Mol Breeding，1998，4：137～145．
[27] 伍宁丰，范云六．含苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白基冈的杨树工程植株的建立[J]． 科学通报，1991，9：705～708．
[28] 陈颖，李强,李玲，等．抗虫转基因欧洲黑杨的Western印迹法分析[J].林业科 学，1996，32(3) ：274～276．
[29] 陈颖,韩一凡，李玲，等．苏云金杆菌杀虫晶体蛋白基冈转化美洲黑杨的研究 [J]．林业科学，1995，31(2) ：97～103．
[30] 王学聘，韩一凡，田颖川，等．抗虫转基因欧美杨的培育[J].林业科学,1997, 33(1) ：69～74．
[31] 王学聘，卞祖娴，张香华，等．欧美杨转基因植株的PCR检测[J]．林业科学， 1997,33(4) : 380～382
[32] 郑均宝，张玉满，田颖川，等．741杨离体叶片再生及抗虫基因转化[J]．河北农 业大学学报．1995． 18(3) ：20～25．
[33] 郝贵霞，朱祯，朱之悌，等．豇豆蛋白酶抑制剂基因转化毛白杨的研究[J]．植物 学报，1999，41(12) ：1276～1282．
[34] 郝贵霞．朱祯，朱之悌．转CpTl基因毛白杨的获得[J]．林业科学，2000，36(1) ： 116～119．
[35] 田颖川，郑均宝，李常青，等．转双抗虫基因杂种741毛白杨的研究[J]．植物学 报，2000,42(3) ：263～268．
[36] 郑均宝，梁海永，田颖川．等．转双抗虫基因741毛白杨的选择及抗虫性[J]．林 业科学，2000,36(2) ：13～19．
[37] 李明亮，张辉，胡建军，等．转Bt基因和蛋白酶抑制剂基因杨树抗虫性的研究[J]． 林业科学，2000，36(2) ；93～97．
[38] 饶红宇，伍宁丰，陈英，等．杨树NL-80106 转Bt基因植株的获得及抗虫性[J]． 植物资源与环境学报．2000，9(2) ：1～5．
[39] Mc cown B H，et al．Stable transformation of Populus and incroporation of pest resistance by electric discharge particle acceleration[J]．Plant cell Reports，1991， 11(7) ：590～594．
[40] Song Y N，Shibuya M，Ebizuka Y，et al．Synergistic action of phendic signal compounds and carbohydrates in the induction of virukence gene expression in Agrobacterium tumefaciens[J]．Chem Pharm Bull，1991，39：2347～2350．
[41] Jacq B，Lesobre O．Sangwan R S，et al．Factors influencing T-DNA transfer in Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of Agrobacterium-mediated transformation ofsugarbeet[J]．Plant Cell Rep，1993，12：621～624．
[42] 李洪清，李美茹．影响农杆菌介导植物基因转化的因素问题[J]．植物生理学通 讯，1999，35(2) ：145～151．
[43] Lan Godwin，et al．The effects of acetosyringone and pH on Agrobacterium mediated transformation vary according to plant species[J]．Plant Molecular Biology Report， 1992，10(1) ：12～36．
[44] 傅荣昭,孙勇如，贾士荣．植物遗传转化技术手册[M]．北京：中国科学技术出 版社，1994．
[45] Turk S C H J，Melchers LS，et al．Environmental conditions differentially affect vir gene induction in different Agrobacterium strains．Role of the VirA sensor protein
[J]．Plant Mol．Biol．，1991，16：1051～1059．
[46] 张根义,徐武，李鸣等．植物细胞感受态研究初探[J]．农业生物技术学报． 1997，5(1) ：100～102．
[47] 韩美丽，陆荣生等．遗传转化技术在树木育种上的研究进展[J]．林业科学， 1997，33(1) ：126～132．
[48] 王瑶，林木兰，沈锡辉，等．农杆菌介导的木本植物遗传转化[J]．生物技术通 讯，1999， 6：23～27．
[49] 王景雪，孙毅．农杆菌介导的植物基因转化研究进展[J]．生物技术通报，1999， 1：7～13．
[50] 华志华，黄大年．转基因植物中外源基因的遗传学行为[J]．植物学报．1999， 41(1) ：1～5．
[51] 胡建军，刘庆一，王克胜，等．欧洲黑杨转Bt毒蛋白基因植株大田抗虫性测定 [J]．林业科学研究，1999，12(2) ：202～205．
[52] 吴刚，崔海瑞，舒庆尧，等．Bt转基因植物研究进展及其持续利用[J]．生物技 术．1999，9(5) ：34～38．
[53] James C．Global review of commercialized transgenic crops：1999[P]．ISAAA Briefs NO．12． ISAAA：Ithaca，NY,1999．
[54] 朱祯,刘翔．转基因作物--恶魔还是救星[J]．农业生物技术学报，2000，8 (1) ：1～5．
[55] Masood E．Food scientist in GMOrow defends"premature"warning[J]．Nature， 1999，398：98．
[56] Masood E．Collapse of talks on safety of GMO trade[J]．Nature，1999，398：6．
[57] Butler D，Reichhardt T. Long-term effect of GM crops serves up food for thought [J]．Nature，1999，398：651～656．
[58] Genetically Modified Plants for Food Use[EB/OL]．The Royal Society Report，Sep 1998，．http：//www．royalsoc．ac．uk/st_po140． htm．
[59] 贾士荣．转基因作物的安全性争论及其对策[J]．生物技术通报，1999． (6) ： 1～7．
[60] 钱迎倩．转基因作物的利弊分析[J]．生物技术通报．1999，(5) ：7～11．
[61] Chrispeels M J，Savada D E．in Plants，Gene and Agriculture，Jones and Bartlett， Boston，MA，USA，1994，pp427．
[62] 李宁，刘信．农业生物工程安全管理与管理能力建设设想[J]．生物技术通报，
1999，(4) ：38～40．
[63] 张执中 主编．森林昆虫学(第2版)[M]．北京：中国林业出版社．1993．
[64] 萧刚柔 主编．中国森林昆虫 第2版(增订本)[M]．北京：中国林业出版 社，1991．
[65] 俞志华．抗虫基冈的抗虫原理及其应用现状和展望[J]．生物学通报．2000， 35(7) ：8～1O．
[66] 王琛柱，钦俊德．植物蛋白酶抑制素抗虫作用的研究进展[J]． 昆虫学报， 1997，40(2) ：212～218．
[67] 王志刚，黄大庄，阎俊杰．桑天牛在不同树种或品种间产卵选择性试验[J]．河 北林学院学报，1994，9(1) ：65～69．
[68] 王西南，李宪臣，范廸,等．桑大牛对白杨派无性系危害程度的研究[J]．林 业科学研究，1998，11(6) ：660～663．
[69] Kazutaka Kato．Kajchiro Kawamura．Clonal variation in sugi on the resistance to Cryptomeria bark borer(Senamotus japonicus Lacordaire)and the population dynamics by setting the bark borer tree in a cage[J]．Bull．For．Tree．Bree．Inst．，1993， (11) ：1～15．
[70] Yoshiyaki Fujimoto，Takehiko Maeta， Masahiro Tajima，et al． Studies on resistant tree breeding to sugi bark midges[J]．Bull．For．Tree．Bree．Inst．，1983(1) ： 109～123．
[71] Lawrence M H，Timothy D P,Jocelyn G M．Mechanisms of resistance in encalyptus against larvae of the eucalyptus long horned borer(Col．Cera．)[J]．Environ． Entomai．，1991，20(6) ：1583～1588．
[72] Anu G M．A method for the evaluation of the resistance of poplars to Phloeomyzus passerinii sign[R]．Proc．FAO/IPC/Working Party on Insects and other Animal Pests (Bucarest，Romania),FO：CIP：1/71/24，1971．
[73] 高瑞桐，杨白湘．汪太振，等．杨树对杨干象抗性选择的研究．杨树遗传改良 [M]．北京：北京农业大学出版社，1991，154～166．
[74] 胡建军．赵自成．苗世龙．等．杨树人工接虫方法的研究[J]．林业科学研究， 1998． 11(6) ：574～580．
[75] 黄大庄著． 桑天牛区域动态规律与综合治理[M]． 哈尔滨：东北林业大学出 版社．1999．
[76] 胡建军．李袆，陈颖，等．杨树抗天牛转基因植株的研究(待发表)．
[77] 刘一樵．李士(言易)．森林植物学[M]．北京：中国林业出版社．1993：263～264．
[78] 青海林业害虫爆发成灾[N]．中国青年报，1998-06-17(2) ．
[79] 天牛：是害虫也是老师[N]．中国青年报，1999-10-24(2) ．
[80] 今年森林病虫害严峻[N]．中国青年报，2000-01-21(2) ．
[81] 陈正华 主编．木本植物组织培养及其应用[M]．北京：高等教育出版社，1986．
[82] 赵世民,祖国诚，刘根齐，等．通过农杆菌介导法将兔防御素NP-1基因导入 毛白杨(P. tometosa)[J]．遗传学报，1999，26(6) ：711～714．
[83] Confalonieri M，Balestrazzi A，Bisoffi S．Genetic transformation of Populus nigra byAgrobacterium tumefaciens[J]．Plant Cell Repon，1994，13：256～261．
[84] Tzfira T,Benmeir H，Vainstein A，et al．Highly efficient transformation and regeneration of aspen plants through shoot-bud formation in root culture[J]．Plant Cell Report，1996，15：566～571．
[85] De Block M． Factors influencing the tissue culture and the Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of hybird aspen and poplar clones[J]．Plant Physiol，1990，93：1110～1116．
[86] Nehra N S，Chibbar R N，Kanha K K，et al．Genetic transformation of strawberry by Agrobacterium tumefaciens using a leaf disk regeneration system[J]． Plant Cell Rep,1990，9：293～298．
[87] Yao J L,Cohen D，Atkinsun R，et al．Regeneration of transgenic plants from the commercial apple cultivar Royal gala[J]．Plant Cell Rep．1995，14：407～412．
[88] 郑均宝．田颖川．莽克强，等．雄性毛白杨离体叶片再生及抗虫基因转化[J]． 河北林学院学报，1996，11(2) ：97～101．
[2] 贾士荣．转基因植物食品中标记基因的安全性评价[J]．中国农业科学，1997，30 (2) ：1～15．
[3] Knight P J K，Crichmore N，et al．The receptor for Bacillus thuringiensis CrylA(c) delta-endotoxin in the brush border membrane of the Lepidopteram Manduca sexta is aminopeptiase N[J]．Mol Microbiol，1994，11：429～430．
[4] Sangadala S，Walters F S，et al．A mixture of Manduca sexta aminopeptidase and phosphatase enhances Bacillus thuringiensis insecticidal CrylA(c) toxin binding and 86Rb+-K+ offlux in vitro[J]．J．Biol Chem，1994，269/10088～10092．
[5] Vadlarnudi R K，Weber E，et al．Cloning and expression of a receptor for an insecticidal toxin of Bacillus thuringiensis[J]．J．Biol Chem，1995，270：5490～5494．
[6] 朱新生，朱玉贤．抗虫植物基因工程研究进展[J]．植物学报，1997，39(3) ： 282～288．
[7] 谢先芝．抗虫转基因植物的研究进展及前景[J]．生物工程进展，1999，19(6) ： 47～51．
[8] 周兆斓，朱祯．植物抗虫基因工程研究进展[J]．生物工程进展，1994，14：18～24．
[9] 毛立群，郭三堆．Genetic engineering on insect-specific neurotoxins：present and future[J]．生物技术通报，1998,6：1～6．
[10] Vardi A，Bleichmans，Aviv D．Genetic transformation of transgenic plant[J]．Plant Science，1990，69：199～206．
[11] 王善平，许农，许智宏，等．利用PEG法对Gus基因在儿种杨树原生质体中瞬间 表达的研究[J]．实验生物学报，1991，24(1) ：71～73．
[12] 朱至清．植物体细胞无性繁殖与改良育种[M]．陈英 主编．江苏科学出版社， 1990：1～7．
[13] 贾敬芬．植物原生质体培养[M]．北京：科学出版社，1990：15～16．
[14] 林万明．核酸探针杂交实验技术[M]．中国科学技术出版社，1991．
[15] 谢友菊．遗传工程概论[M]．北京农业大学出版社，1992．
[16] 田颖川，韩一凡，李太元，等．抗虫转基因欧洲黑杨的培育[J]．生物工程学报， 1993，9(4) ：291～297．
[17] Karl W K，David D E，et al．Field evalumion of transgenic poplar expressing a
Bacillus thuringiensis CrylA(a) d-Endotoxin gene against forest tent caterpillar (Lepidoptera：Lecsiocampidae)and gypsy moth(L:Lymantriidae)following winter dormancy[J]．Environ．Entomol，1995，24(5) ：1358～1364．
[18] 胡廷章,徐云剑，江国英,等．转 BmK IT4基因烟草的抗虫性[J]．植物学报， 2000，42(7) ：732～735．
[19] Mcnabb．H S，et al．A field trial of transgenic hybrid poplar trees：establishment and growth through the second season[J]．Agroculture Resarch Institute，1991：155～159．
[20] Klopeensten N B，et al．Transgenic Populus hybrid express a wound-inducible potato proteinase inhibitor Ⅱ-CAT fusion[J]．Can．J．Forest．Res，199l，21：1321～1328．
[21] Klopeensten，N B，et al．Transformation of Populus hybrids to study and improve pest resistance[J]．Silvae Genetica,1993，42(2-3) ：86～90．
[22] Howe G T, Goldfarb B，et al．Agrobacterium-mediated transformation of hybrid poplar suspension cultures and regeneration of transformed plants[J]．Plant cell， Tissue and Organ Culture，1994，36：59～71．
[23] Leple J C，Brasileiro A C M．Transgenic poplars：expression of chimeric genes using four different constructs[J]．Michel．plant cell Reports，1992，11：137～141．
[24] Leple J C，et al．Transgenic poplars：expression of chimeric genes using four different constructs[J]．Plant Cell Report，1992，11：173～181．
[25] Ann，S M．Science，1996，271(9) ：670～671．
[26] Confalonieri M，Allegro G，Balestrazzi A et al．Regeneration of Populus nigra transgenic plants expressing a Kunitz proteinase inhibitor(Kti 3) gene[J]．Mol Breeding，1998，4：137～145．
[27] 伍宁丰，范云六．含苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白基冈的杨树工程植株的建立[J]． 科学通报，1991，9：705～708．
[28] 陈颖，李强,李玲，等．抗虫转基因欧洲黑杨的Western印迹法分析[J].林业科 学，1996，32(3) ：274～276．
[29] 陈颖,韩一凡，李玲，等．苏云金杆菌杀虫晶体蛋白基冈转化美洲黑杨的研究 [J]．林业科学，1995，31(2) ：97～103．
[30] 王学聘，韩一凡，田颖川，等．抗虫转基因欧美杨的培育[J].林业科学,1997, 33(1) ：69～74．
[31] 王学聘，卞祖娴，张香华，等．欧美杨转基因植株的PCR检测[J]．林业科学， 1997,33(4) : 380～382
[32] 郑均宝，张玉满，田颖川，等．741杨离体叶片再生及抗虫基因转化[J]．河北农 业大学学报．1995． 18(3) ：20～25．
[33] 郝贵霞，朱祯，朱之悌，等．豇豆蛋白酶抑制剂基因转化毛白杨的研究[J]．植物 学报，1999，41(12) ：1276～1282．
[34] 郝贵霞．朱祯，朱之悌．转CpTl基因毛白杨的获得[J]．林业科学，2000，36(1) ： 116～119．
[35] 田颖川，郑均宝，李常青，等．转双抗虫基因杂种741毛白杨的研究[J]．植物学 报，2000,42(3) ：263～268．
[36] 郑均宝，梁海永，田颖川．等．转双抗虫基因741毛白杨的选择及抗虫性[J]．林 业科学，2000,36(2) ：13～19．
[37] 李明亮，张辉，胡建军，等．转Bt基因和蛋白酶抑制剂基因杨树抗虫性的研究[J]． 林业科学，2000，36(2) ；93～97．
[38] 饶红宇，伍宁丰，陈英，等．杨树NL-80106 转Bt基因植株的获得及抗虫性[J]． 植物资源与环境学报．2000，9(2) ：1～5．
[39] Mc cown B H，et al．Stable transformation of Populus and incroporation of pest resistance by electric discharge particle acceleration[J]．Plant cell Reports，1991， 11(7) ：590～594．
[40] Song Y N，Shibuya M，Ebizuka Y，et al．Synergistic action of phendic signal compounds and carbohydrates in the induction of virukence gene expression in Agrobacterium tumefaciens[J]．Chem Pharm Bull，1991，39：2347～2350．
[41] Jacq B，Lesobre O．Sangwan R S，et al．Factors influencing T-DNA transfer in Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of Agrobacterium-mediated transformation ofsugarbeet[J]．Plant Cell Rep，1993，12：621～624．
[42] 李洪清，李美茹．影响农杆菌介导植物基因转化的因素问题[J]．植物生理学通 讯，1999，35(2) ：145～151．
[43] Lan Godwin，et al．The effects of acetosyringone and pH on Agrobacterium mediated transformation vary according to plant species[J]．Plant Molecular Biology Report， 1992，10(1) ：12～36．
[44] 傅荣昭,孙勇如，贾士荣．植物遗传转化技术手册[M]．北京：中国科学技术出 版社，1994．
[45] Turk S C H J，Melchers LS，et al．Environmental conditions differentially affect vir gene induction in different Agrobacterium strains．Role of the VirA sensor protein
[J]．Plant Mol．Biol．，1991，16：1051～1059．
[46] 张根义,徐武，李鸣等．植物细胞感受态研究初探[J]．农业生物技术学报． 1997，5(1) ：100～102．
[47] 韩美丽，陆荣生等．遗传转化技术在树木育种上的研究进展[J]．林业科学， 1997，33(1) ：126～132．
[48] 王瑶，林木兰，沈锡辉，等．农杆菌介导的木本植物遗传转化[J]．生物技术通 讯，1999， 6：23～27．
[49] 王景雪，孙毅．农杆菌介导的植物基因转化研究进展[J]．生物技术通报，1999， 1：7～13．
[50] 华志华，黄大年．转基因植物中外源基因的遗传学行为[J]．植物学报．1999， 41(1) ：1～5．
[51] 胡建军，刘庆一，王克胜，等．欧洲黑杨转Bt毒蛋白基因植株大田抗虫性测定 [J]．林业科学研究，1999，12(2) ：202～205．
[52] 吴刚，崔海瑞，舒庆尧，等．Bt转基因植物研究进展及其持续利用[J]．生物技 术．1999，9(5) ：34～38．
[53] James C．Global review of commercialized transgenic crops：1999[P]．ISAAA Briefs NO．12． ISAAA：Ithaca，NY,1999．
[54] 朱祯,刘翔．转基因作物--恶魔还是救星[J]．农业生物技术学报，2000，8 (1) ：1～5．
[55] Masood E．Food scientist in GMOrow defends"premature"warning[J]．Nature， 1999，398：98．
[56] Masood E．Collapse of talks on safety of GMO trade[J]．Nature，1999，398：6．
[57] Butler D，Reichhardt T. Long-term effect of GM crops serves up food for thought [J]．Nature，1999，398：651～656．
[58] Genetically Modified Plants for Food Use[EB/OL]．The Royal Society Report，Sep 1998，．http：//www．royalsoc．ac．uk/st_po140． htm．
[59] 贾士荣．转基因作物的安全性争论及其对策[J]．生物技术通报，1999． (6) ： 1～7．
[60] 钱迎倩．转基因作物的利弊分析[J]．生物技术通报．1999，(5) ：7～11．
[61] Chrispeels M J，Savada D E．in Plants，Gene and Agriculture，Jones and Bartlett， Boston，MA，USA，1994，pp427．
[62] 李宁，刘信．农业生物工程安全管理与管理能力建设设想[J]．生物技术通报，
1999，(4) ：38～40．
[63] 张执中 主编．森林昆虫学(第2版)[M]．北京：中国林业出版社．1993．
[64] 萧刚柔 主编．中国森林昆虫 第2版(增订本)[M]．北京：中国林业出版 社，1991．
[65] 俞志华．抗虫基冈的抗虫原理及其应用现状和展望[J]．生物学通报．2000， 35(7) ：8～1O．
[66] 王琛柱，钦俊德．植物蛋白酶抑制素抗虫作用的研究进展[J]． 昆虫学报， 1997，40(2) ：212～218．
[67] 王志刚，黄大庄，阎俊杰．桑天牛在不同树种或品种间产卵选择性试验[J]．河 北林学院学报，1994，9(1) ：65～69．
[68] 王西南，李宪臣，范廸,等．桑大牛对白杨派无性系危害程度的研究[J]．林 业科学研究，1998，11(6) ：660～663．
[69] Kazutaka Kato．Kajchiro Kawamura．Clonal variation in sugi on the resistance to Cryptomeria bark borer(Senamotus japonicus Lacordaire)and the population dynamics by setting the bark borer tree in a cage[J]．Bull．For．Tree．Bree．Inst．，1993， (11) ：1～15．
[70] Yoshiyaki Fujimoto，Takehiko Maeta， Masahiro Tajima，et al． Studies on resistant tree breeding to sugi bark midges[J]．Bull．For．Tree．Bree．Inst．，1983(1) ： 109～123．
[71] Lawrence M H，Timothy D P,Jocelyn G M．Mechanisms of resistance in encalyptus against larvae of the eucalyptus long horned borer(Col．Cera．)[J]．Environ． Entomai．，1991，20(6) ：1583～1588．
[72] Anu G M．A method for the evaluation of the resistance of poplars to Phloeomyzus passerinii sign[R]．Proc．FAO/IPC/Working Party on Insects and other Animal Pests (Bucarest，Romania),FO：CIP：1/71/24，1971．
[73] 高瑞桐，杨白湘．汪太振，等．杨树对杨干象抗性选择的研究．杨树遗传改良 [M]．北京：北京农业大学出版社，1991，154～166．
[74] 胡建军．赵自成．苗世龙．等．杨树人工接虫方法的研究[J]．林业科学研究， 1998． 11(6) ：574～580．
[75] 黄大庄著． 桑天牛区域动态规律与综合治理[M]． 哈尔滨：东北林业大学出 版社．1999．
[76] 胡建军．李袆，陈颖，等．杨树抗天牛转基因植株的研究(待发表)．
[77] 刘一樵．李士(言易)．森林植物学[M]．北京：中国林业出版社．1993：263～264．
[78] 青海林业害虫爆发成灾[N]．中国青年报，1998-06-17(2) ．
[79] 天牛：是害虫也是老师[N]．中国青年报，1999-10-24(2) ．
[80] 今年森林病虫害严峻[N]．中国青年报，2000-01-21(2) ．
[81] 陈正华 主编．木本植物组织培养及其应用[M]．北京：高等教育出版社，1986．
[82] 赵世民,祖国诚，刘根齐，等．通过农杆菌介导法将兔防御素NP-1基因导入 毛白杨(P. tometosa)[J]．遗传学报，1999，26(6) ：711～714．
[83] Confalonieri M，Balestrazzi A，Bisoffi S．Genetic transformation of Populus nigra byAgrobacterium tumefaciens[J]．Plant Cell Repon，1994，13：256～261．
[84] Tzfira T,Benmeir H，Vainstein A，et al．Highly efficient transformation and regeneration of aspen plants through shoot-bud formation in root culture[J]．Plant Cell Report，1996，15：566～571．
[85] De Block M． Factors influencing the tissue culture and the Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of hybird aspen and poplar clones[J]．Plant Physiol，1990，93：1110～1116．
[86] Nehra N S，Chibbar R N，Kanha K K，et al．Genetic transformation of strawberry by Agrobacterium tumefaciens using a leaf disk regeneration system[J]． Plant Cell Rep,1990，9：293～298．
[87] Yao J L,Cohen D，Atkinsun R，et al．Regeneration of transgenic plants from the commercial apple cultivar Royal gala[J]．Plant Cell Rep．1995，14：407～412．
[88] 郑均宝．田颖川．莽克强，等．雄性毛白杨离体叶片再生及抗虫基因转化[J]． 河北林学院学报，1996，11(2) ：97～101．