盐酸克仑特罗ELISA方法的建立及用噬菌体展示技术筛选其模拟表位
|
摘要
盐酸克仑特罗(Clenbuterol，CLB)，俗称瘦肉精，是一种β_2-肾上腺素受体激动剂。作为治疗哮喘药物已经有30多年了。不幸的是这类药物被非法用来作为家畜的生长促进剂，用以改善营养物质在脂肪和肌肉之间的重新分配，增加瘦肉。这种非法应用会对食用残留有此类药物畜产品的消费者产生毒害作用，给人民的身体健康和生命安全造成潜在的危害。因此，世界上许多国家都禁止在畜牧业上使用盐酸克仑特罗。为了防止对人类的危害，必须建立快速、灵敏、有效的检测方法。ELISA方法检测盐酸克仑特罗残留是一种快捷、可靠的方法，可在实际检测中应用。噬菌体肽库展示技术近年来发展很快，可以用来淘选CLB替代抗原的模拟表位。这也为其它小分子半抗原物质的ELISA方法的建立提供新的思路。
本论文主要包含两部分内容：
1建立盐酸克仑特罗间接竞争ELISA检测方法。
2用噬菌体肽库展示技术淘选盐酸克仑特罗替代抗原的模拟表位。
第一部分包括盐酸克仑特罗偶联抗原的合成，单克隆抗体的纯化和效价的测定，ELISA各个影响因素最佳条件的优化，该ELISA方法性能的评价等。根据实验建立了盐酸克仑特罗间接竞争ELISA检测方法，包被偶联抗原为0.5ng／mL，加入CLB单抗原液稀释为1∶250000，酶标二抗原液稀释为1∶5000。其间接竞争标准曲线其线性范围为0.38—50ng／mL，IC_(50)为6.25ng／mL，检测下限为0.19ng／mL。曲线方程为y=35.149x+19.145，R=0.99378。批内和批间的变异系数分别为8.3％和9.97％。进行样品加标回收实验，平均回收率为93.14％。
第二部分包括以抗CLB的单克隆抗体为靶分子，从噬菌体随机7肽库中进行4轮亲和淘选。从第4轮噬菌平板上随机挑选18个噬菌斑，经间接ELISA和间接竞争ELISA鉴定，挑选出6个合适的噬菌体。经测序可知其序全列为N—His—His—Thr—Phe—Phe—Lys—His—C。用噬菌体P8替代CLB抗原建立了间接竞争ELISA标准曲线，并用该噬菌体进行样品加标回收实验。
Clbuterol (CLB) is one of theβ—Adrenergic agonist. It has beenused as bronchiodilators in human medicine for over 30 years.Unfortunately, it has been illegally used toenhance the growth, ratesof livestock and to promote the repartition from fat into muscle. Itmay lead to toxic effects after consumption of meat products containingCLB. A lot of countries in the world have banned the use of CLB so arapid and reliable method to detect CLB is needed. ELISA, which is arapid and sensitive detection method compared to other ones and can beused to screen CLB. Phage display is a new technology and has a rapiddevelopment. Itcan be applied in panning the Mimotopes of CLB as thesurrogate of CLB. This use of peptide libraries as sources of reagentsin immunoassays could be applicable in ELISA tests for other low-weighttoxic chemicals.
The main results are as follows:
1 Development of the indirect competitive ELISA of CLB.
2 Panning mimotopes of CLB by phage display peptide library.
Part one includes conjugating of CLB—BSA, detection of monoclonalantibody titers and purity, selection of ELISA factors, and evaluationof ELISA, etc. The method of ELISA was established by optimizing.parameters. The experiment results showed that the optimumconcentrations of BSA-CLB, monoclonal antibody against CLB andanti-mouse IgG were 0.5ng/mL, 1:250000 and 1:5000 respectively. Theindirect competitive ELISA curves were established, linear range of theinhibition curves was between 0.38ng/mL and 50ng/mL, IC_(50) was 6.25 ng/mL,and the detectioh limit was 0.19ng/mL. The variation coefficients ofintra-assay and inter-assay were 8.3％and 9,97％respectively. Averagerecovery of CLB samples was 93.14％.
In part two, the anti-CLB monoclonal antibody was used as ligand to pan the binding peptide from the Ph. D.-7~(TM) phage display peptide library.After four rounds of panning, 18 Clones were randomly picked from thefourth round. Those phage plaques were amplified and purified. Six of.the eighteen clones were identified positive by indirect ELISA. Thesequences of all. clones were His—His—Thr—Phe—Phe—Lys—His; Theindirect competitive ELISA curves were established for clone phage PS.Finally, ELISA was eastablished byclone phage which substitutes forCLB-BSA. Recovery of CLB samples was tested.
本论文主要包含两部分内容：
1建立盐酸克仑特罗间接竞争ELISA检测方法。
2用噬菌体肽库展示技术淘选盐酸克仑特罗替代抗原的模拟表位。
第一部分包括盐酸克仑特罗偶联抗原的合成，单克隆抗体的纯化和效价的测定，ELISA各个影响因素最佳条件的优化，该ELISA方法性能的评价等。根据实验建立了盐酸克仑特罗间接竞争ELISA检测方法，包被偶联抗原为0.5ng／mL，加入CLB单抗原液稀释为1∶250000，酶标二抗原液稀释为1∶5000。其间接竞争标准曲线其线性范围为0.38—50ng／mL，IC_(50)为6.25ng／mL，检测下限为0.19ng／mL。曲线方程为y=35.149x+19.145，R=0.99378。批内和批间的变异系数分别为8.3％和9.97％。进行样品加标回收实验，平均回收率为93.14％。
第二部分包括以抗CLB的单克隆抗体为靶分子，从噬菌体随机7肽库中进行4轮亲和淘选。从第4轮噬菌平板上随机挑选18个噬菌斑，经间接ELISA和间接竞争ELISA鉴定，挑选出6个合适的噬菌体。经测序可知其序全列为N—His—His—Thr—Phe—Phe—Lys—His—C。用噬菌体P8替代CLB抗原建立了间接竞争ELISA标准曲线，并用该噬菌体进行样品加标回收实验。
Clbuterol (CLB) is one of theβ—Adrenergic agonist. It has beenused as bronchiodilators in human medicine for over 30 years.Unfortunately, it has been illegally used toenhance the growth, ratesof livestock and to promote the repartition from fat into muscle. Itmay lead to toxic effects after consumption of meat products containingCLB. A lot of countries in the world have banned the use of CLB so arapid and reliable method to detect CLB is needed. ELISA, which is arapid and sensitive detection method compared to other ones and can beused to screen CLB. Phage display is a new technology and has a rapiddevelopment. Itcan be applied in panning the Mimotopes of CLB as thesurrogate of CLB. This use of peptide libraries as sources of reagentsin immunoassays could be applicable in ELISA tests for other low-weighttoxic chemicals.
The main results are as follows:
1 Development of the indirect competitive ELISA of CLB.
2 Panning mimotopes of CLB by phage display peptide library.
Part one includes conjugating of CLB—BSA, detection of monoclonalantibody titers and purity, selection of ELISA factors, and evaluationof ELISA, etc. The method of ELISA was established by optimizing.parameters. The experiment results showed that the optimumconcentrations of BSA-CLB, monoclonal antibody against CLB andanti-mouse IgG were 0.5ng/mL, 1:250000 and 1:5000 respectively. Theindirect competitive ELISA curves were established, linear range of theinhibition curves was between 0.38ng/mL and 50ng/mL, IC_(50) was 6.25 ng/mL,and the detectioh limit was 0.19ng/mL. The variation coefficients ofintra-assay and inter-assay were 8.3％and 9,97％respectively. Averagerecovery of CLB samples was 93.14％.
In part two, the anti-CLB monoclonal antibody was used as ligand to pan the binding peptide from the Ph. D.-7~(TM) phage display peptide library.After four rounds of panning, 18 Clones were randomly picked from thefourth round. Those phage plaques were amplified and purified. Six of.the eighteen clones were identified positive by indirect ELISA. Thesequences of all. clones were His—His—Thr—Phe—Phe—Lys—His; Theindirect competitive ELISA curves were established for clone phage PS.Finally, ELISA was eastablished byclone phage which substitutes forCLB-BSA. Recovery of CLB samples was tested.
引文
[1] 于洪侠．莱克多巴胺酶联免疫吸附法(ELISA)的建立：[硕士学位论文]．北京：农业质量标准与检测技术研究所，2005
[2] 刘国艳，柴春彦．如何全面认识“瘦肉精”[J]．动物科学与动物医学，2002，19(6)：1～3
[3] 曲勍．抗莱克多巴胺单克隆抗体制备与ELISA方法的建立：[硕士学位论文]．北京：中国农业大学，2005
[4] 许春光，杨克军．酶联免疫技术在生猪盐酸克伦特罗检测中的应用[J]．现代仪器，2005，6：46～47
[5] Sauern M.J,pickett R J H, Limer S, et al. Distribution and elimination of clenbuterol in tissue and fluids of calves following prolonged oral administration at a growth-promoting dose[J].J.Vet.Pharmacol.Therap,1995,18:81～86
[6] 贾强，张振玲，王筱芬．“瘦肉精”毒性作用及检测方法研究进展[J]．职业与健康，2005，21，(2)：202～203
[7] 林海丹，江庆娣，伍绍登．饲料中盐酸克伦特罗含量的检测[J]．饲料工业，2000，21(1)：25～26
[8] 张园园．克伦特罗的毒性作用及中毒机制[J]．卫生研究 2002，31(4)：13～14
[9] 臧鹏伟，范万东，张振岚等．两种克伦特罗ELISA试剂盒的比对试验[J]．畜牧与兽医，2005，37(10)：45～46
[10] 杨浩峰，严蕾．盐酸克伦特罗的药理作用、危害及检测[J]．地方病通报．200621(1)：101～104
[11] 严莉．盐酸克仑特罗在动物组织中的残留分布及其毒性的研究：[硕士学位论文]．成都：四川农业大学，2004
[12] 陈一农，张吟，郑兴中等．中毒剂量与治疗剂量克仑特罗在兔体内的药动学研究[J]．中国现代应用药学杂志，2005，22(4)：272～275
[13] 杨志凌，林映才，郑黎等．β—激动剂在畜禽体内的残留[J]．养猪业，2002，1(1)34～37
[14] 魏万贵，吴忠勤，王莉等．动物源性食品中盐酸克仑特罗残留检测技术平台的建立及应用[J]．中国卫生工程学，2005，4(5)：287～289
[15] 杨传波．盐酸克论特罗单克隆抗体的制备及竞争ELISA检测方法的建立：[硕士学位论文]．重庆：西南农业大学，2005
[16] 吕存娣，生猪“瘦肉精”问题的现状与对策[J]．福建畜牧兽医 2001(2)：18～19
[17] 史良雨，华声堂．动物源性食品安全管理及应对措施[J]．中国动物检疫，2003，20(3)：12～13
[18] 刘琪，叶妮，王树槐．克伦特罗残留的GC-MS确证分析及应注意的事项[J]．分析测试学报，2004，23：214～213
[19] 陈雷岚．建立酶联免疫吸附法检测 赭曲霉毒素A[硕士学位论文]．南昌：南昌大学中德联合研究院，2002
[20] Alodo R, Anna c m, Francesco P, et al. Arapid and sensitive 384-microtiter wells format chemiluminescent enzyme immunoassay for clenbuterol [J]. taianta,2000,52:311～318
[21] Saways W N,Lone K, Husain A, et al. Screening for B-Agonists in sheep urine and eyes by an enzyme-linked immunosorbent assay in the state of Kuwait[J].Food Contral,2000,11; 1-5
[22] Andrzej Posyniak*, Jan Zmudzki, Jolanta Niedzielska. Screening procedures for clenbuterol residue determination in bovine urine and liver matrices using enzyme-linked immunosorbent assay and liquid chromatography[J].Analytica Chimica Acta,2003 (483):61～67
[23] Shelver W L, Smith D J. Development of an immuunoassay for theβ-adrenergic agonist ractopamine [J]. Immunoassay,2000,21(1):1223.
[24] 周大勇．诺氟沙星的ELISA方法建立[硕士学位论文]。上海：上海水产大学，2003
[25] 胥传来，李相前，邵蔚蓝．一种盐酸克伦特罗酶联免疫检测试剂盒及其检测方法[P]，中国，CN1389730
[26] V. Cirimeleab*, S. Etieunea, M. Villaina, B. Ludesa, P. Kintza. Evaluation of the One-StepTMELISA kit for the detection of buprenorphine in urine, blood, and hair specimens[J].Forensic Science International, 2004 (143):153-156
[27] Iris G.Lange,Andreas Daxenberger,Heinrich H.D.Meyer. Study on the antibody response of Lamaglama-evaluation of binding capacity of different IgG subtypes in ELISA for clenbuterol and BSA[J].Veterinary Immunology and Immunopathology, 2001,83:1-9
[28] 邱伟芬．酶联免疫吸附分析及其在食品安全检测中的应用[J]．粮食与饲料工业，2004，3
[29] 于洪侠，杨曙明．莱克多巴胺人工抗原的合成与鉴定[J]．中国兽医科技，2000，35(12)1000～1003
[30] 于洪侠，杨曙明．莱克多巴胺残留检测方法研究进展[J]．中国兽药杂志，2004，38(11)：44～47
[31] 江湖．黄曲霉毒素B1间接竞争检测方法的建立与单克隆抗体免疫亲合柱的初步研究：[硕士学位论文]．南昌：南昌大学中德联合研究院，2005
[32] 陈蔚青，孟莉英．噬菌体展示技术研究进展．科技通报[J]，2005，21(3)：275～279
[33] Smith GP. Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface[y]. Science, 1985, 228 (4705): 1315～1317.
[34] Cott JK, Smith GP. Searching for peptide ligands with an epitope library[J]. Science. 1990, 245: 386～390.
[35] Mc Cafferty J, Griffiths AD, Winter G, et al. Phage antibodies:filamentous phage displaying antibody variable domains[J]. Nature. 1990. 348: 552～554.
[36] 黄丽群，郑捷．从噬菌体肽库中筛选抗原模拟表位的研究进展[J]．国外医学皮肤性病学分册，2004，30(6)：390～392
[37] 戴和平，高宏，赵新颜．噬菌体展示技术的原理和方法[J]．水生生物学报，2002，26(4)：400～409．
[38] [2c]武婕，陈惠鹏．噬菌体肽库研究进展[J]．军事医学科学院院刊，2000，24(1)：61～64
[39] 李丽芳，张映．噬菌体展示文库的筛选技术[J]．生物技术通报，2005，4：36～38
[40] Parish D, Purohit A,Singh A,et al. Peptide inhibition of cytokine2stimu-lated aromatase activity in breast tissue fibroblasts. J Steroid Biochem &Mol Biol,2001,79:165～172.
[41] 高学良，钱文，赵群飞．噬菌体展示技术的发展及应用[J]．生命的化学，2001，21(5)：432～433．
[42] 祝仁发，黄莉清，何后军等．噬菌体展示系统及筛选技术研究进展[J]．中国生物工程杂志，2005，(增)：23～26
[43] 王宪文，毕英佐，曹永长．噬菌体肽库技术的应用[J]．生物技术通讯，2004，15(5) 489～492
[44] Hartley O. The use of phage display in the study of receptors and their lignnds. J Recept Signal Transduct Res. 2002, 22 (1-4): 373～392
[45] Petrenko V. A, Vodyanoy V. J. Phage display for detection of biological threat agents. J Microbiol Methods. 2003, 53 (2): 253～262
[46] 应用噬菌体表面展示肽库快速筛选肽配体使用手册[Z]。 http://www.biofriendship.com.cn/jiesjuefangan/protoscript_man.pdf, 2007-3-24
[47] 王小平，刘彦仿．噬菌体表面展示技术[J]．生物学杂志，1999，16(5)：7～8
[48] 赵慧斌．噬菌体抗体库筛选技术[J]．临床检验杂志，2004，22(2)：146～148．
[49] 吕勇刚，窦科峰，吴昱彤等．大容量人乳腺癌单链抗体库的构建与初步鉴定[J]．现代肿瘤医学，2006，14(2)：129～131．
[50] 岳建华，潘秀珍，王长军等．EBV转化B型健康人B淋巴细胞构建噬菌体抗体库[J]．免疫学杂志，2006，22(1)：23～26．
[51] Sparks A.B, Quilliam L. A, Thorn J. M, et al. Identification and characterization of Src SH3 ligands from phage-displayed random peptide libraries. J Biol Chem. 1994, 269:23853～23856
[52] Deleo F. R, Yu L, Burritt J. B, et al. Mapping sites of interaction of p47-phox and flavocytochrome b with random-sequence peptide phage display libraries. Proc Natl Acad Sci. 1995, 92:7110～7114
[53] 余传信，朱荫昌，殷旭仁等．利用噬菌体展示技术筛选日本血吸虫模拟抗原表位[J]．中国血吸虫病防治杂志，2002，14(5)：334～337．
[54] 田旺，李正赫，曹学琳等．应用噬菌体随机肽库技术研究干扰素-α2b抗原表位[J]．中华微生物学和免疫学杂志，2005，25(7)：578-582．
[55] Motti C, Nuzzo M, Meola A, et al. Recognition by human sera and immunogenicity of HBsAg mimotopes selected from an M13 phage display library[J]. Gene, 1994,146: 191～198.
[56] 李鹏，赖卫华，陈雪岚等．盐酸克仑特罗ELISA试剂盒的研制[J]．食品科学，2006，296(27)：296～300
[57] 赖卫华，熊勇华，许扬等．应用胶体金试纸条快速检测的研究[J]．食品科学，2005，126(5)：204～207
[58] 刘祖勇．增加洗板次数对HBsAgELISA检测结果的影响[J]．中国输血杂志，2006，19(2)：135～136
[59] S.Gumber a, G. Eamensb, R.J.Whittington a*.Evaluation of a Pourquier ELISA kit in relation to agar gel immunodiffusion (AGID) test for assessment of the humoral immune response in sheep and goats with and without Mycobacterium paratuberculosis infection Veterinary Microbiology 115 (2006):91～101
[60] 邓省亮．1 黄曲霉毒素B_1胶体金免疫层析快速检测方法的研究 2 应用噬菌体展示肽库淘选黄曲霉毒素B_1模拟表位：[硕士学位论文]．南昌：南昌大学中德联合研究院，2006
[61] 王选年，杨艳艳，邢广旭等．盐酸克伦特罗单抗快速检测试剂盒的研制[J]．中国兽医学 报，2004，24(1)：75～78
[62] 赵明军，谌南辉，王平等．噬菌体展示三肽囊素模拟肽的研究[J]．中国预防兽医学报，2005，27(4)：277～282．
[63] 张扬．利用噬菌体展示肽库筛选和鉴定沙门氏菌09抗原的模拟表位[硕士学位论文]．扬州大学．2001，26～28
[64] 肖昌．应用噬菌体肽库鉴定猪瘟病毒E2蛋白抗原表位[硕士学位论文]．中国人民解放军军需大学．2002，32～34
[65] 张晖．利用噬菌体展示技术筛选Gal-1α，3-Gal的模拟肽[硕士学位论文]．浙江大学．2003，23～25
[66] 俞海青，顾晓波．交替洗脱法筛选高亲和力噬菌体肽[J]．生物技术通讯，2003，14(6)：499～516．
[67] Kotz J. D, Bond C. J, Cochran A. G. Phage-display as a tool for quantifying protein stability determinants. Eur J Biochem. 2004, 271(9): 1623～1629
[68] 刘仁荣．赭曲霉毒素A无毒酶联免疫吸附检测方法建立研究：[博士学位论文]．南昌：南昌大学中德联合研究院，2005
[2] 刘国艳，柴春彦．如何全面认识“瘦肉精”[J]．动物科学与动物医学，2002，19(6)：1～3
[3] 曲勍．抗莱克多巴胺单克隆抗体制备与ELISA方法的建立：[硕士学位论文]．北京：中国农业大学，2005
[4] 许春光，杨克军．酶联免疫技术在生猪盐酸克伦特罗检测中的应用[J]．现代仪器，2005，6：46～47
[5] Sauern M.J,pickett R J H, Limer S, et al. Distribution and elimination of clenbuterol in tissue and fluids of calves following prolonged oral administration at a growth-promoting dose[J].J.Vet.Pharmacol.Therap,1995,18:81～86
[6] 贾强，张振玲，王筱芬．“瘦肉精”毒性作用及检测方法研究进展[J]．职业与健康，2005，21，(2)：202～203
[7] 林海丹，江庆娣，伍绍登．饲料中盐酸克伦特罗含量的检测[J]．饲料工业，2000，21(1)：25～26
[8] 张园园．克伦特罗的毒性作用及中毒机制[J]．卫生研究 2002，31(4)：13～14
[9] 臧鹏伟，范万东，张振岚等．两种克伦特罗ELISA试剂盒的比对试验[J]．畜牧与兽医，2005，37(10)：45～46
[10] 杨浩峰，严蕾．盐酸克伦特罗的药理作用、危害及检测[J]．地方病通报．200621(1)：101～104
[11] 严莉．盐酸克仑特罗在动物组织中的残留分布及其毒性的研究：[硕士学位论文]．成都：四川农业大学，2004
[12] 陈一农，张吟，郑兴中等．中毒剂量与治疗剂量克仑特罗在兔体内的药动学研究[J]．中国现代应用药学杂志，2005，22(4)：272～275
[13] 杨志凌，林映才，郑黎等．β—激动剂在畜禽体内的残留[J]．养猪业，2002，1(1)34～37
[14] 魏万贵，吴忠勤，王莉等．动物源性食品中盐酸克仑特罗残留检测技术平台的建立及应用[J]．中国卫生工程学，2005，4(5)：287～289
[15] 杨传波．盐酸克论特罗单克隆抗体的制备及竞争ELISA检测方法的建立：[硕士学位论文]．重庆：西南农业大学，2005
[16] 吕存娣，生猪“瘦肉精”问题的现状与对策[J]．福建畜牧兽医 2001(2)：18～19
[17] 史良雨，华声堂．动物源性食品安全管理及应对措施[J]．中国动物检疫，2003，20(3)：12～13
[18] 刘琪，叶妮，王树槐．克伦特罗残留的GC-MS确证分析及应注意的事项[J]．分析测试学报，2004，23：214～213
[19] 陈雷岚．建立酶联免疫吸附法检测 赭曲霉毒素A[硕士学位论文]．南昌：南昌大学中德联合研究院，2002
[20] Alodo R, Anna c m, Francesco P, et al. Arapid and sensitive 384-microtiter wells format chemiluminescent enzyme immunoassay for clenbuterol [J]. taianta,2000,52:311～318
[21] Saways W N,Lone K, Husain A, et al. Screening for B-Agonists in sheep urine and eyes by an enzyme-linked immunosorbent assay in the state of Kuwait[J].Food Contral,2000,11; 1-5
[22] Andrzej Posyniak*, Jan Zmudzki, Jolanta Niedzielska. Screening procedures for clenbuterol residue determination in bovine urine and liver matrices using enzyme-linked immunosorbent assay and liquid chromatography[J].Analytica Chimica Acta,2003 (483):61～67
[23] Shelver W L, Smith D J. Development of an immuunoassay for theβ-adrenergic agonist ractopamine [J]. Immunoassay,2000,21(1):1223.
[24] 周大勇．诺氟沙星的ELISA方法建立[硕士学位论文]。上海：上海水产大学，2003
[25] 胥传来，李相前，邵蔚蓝．一种盐酸克伦特罗酶联免疫检测试剂盒及其检测方法[P]，中国，CN1389730
[26] V. Cirimeleab*, S. Etieunea, M. Villaina, B. Ludesa, P. Kintza. Evaluation of the One-StepTMELISA kit for the detection of buprenorphine in urine, blood, and hair specimens[J].Forensic Science International, 2004 (143):153-156
[27] Iris G.Lange,Andreas Daxenberger,Heinrich H.D.Meyer. Study on the antibody response of Lamaglama-evaluation of binding capacity of different IgG subtypes in ELISA for clenbuterol and BSA[J].Veterinary Immunology and Immunopathology, 2001,83:1-9
[28] 邱伟芬．酶联免疫吸附分析及其在食品安全检测中的应用[J]．粮食与饲料工业，2004，3
[29] 于洪侠，杨曙明．莱克多巴胺人工抗原的合成与鉴定[J]．中国兽医科技，2000，35(12)1000～1003
[30] 于洪侠，杨曙明．莱克多巴胺残留检测方法研究进展[J]．中国兽药杂志，2004，38(11)：44～47
[31] 江湖．黄曲霉毒素B1间接竞争检测方法的建立与单克隆抗体免疫亲合柱的初步研究：[硕士学位论文]．南昌：南昌大学中德联合研究院，2005
[32] 陈蔚青，孟莉英．噬菌体展示技术研究进展．科技通报[J]，2005，21(3)：275～279
[33] Smith GP. Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface[y]. Science, 1985, 228 (4705): 1315～1317.
[34] Cott JK, Smith GP. Searching for peptide ligands with an epitope library[J]. Science. 1990, 245: 386～390.
[35] Mc Cafferty J, Griffiths AD, Winter G, et al. Phage antibodies:filamentous phage displaying antibody variable domains[J]. Nature. 1990. 348: 552～554.
[36] 黄丽群，郑捷．从噬菌体肽库中筛选抗原模拟表位的研究进展[J]．国外医学皮肤性病学分册，2004，30(6)：390～392
[37] 戴和平，高宏，赵新颜．噬菌体展示技术的原理和方法[J]．水生生物学报，2002，26(4)：400～409．
[38] [2c]武婕，陈惠鹏．噬菌体肽库研究进展[J]．军事医学科学院院刊，2000，24(1)：61～64
[39] 李丽芳，张映．噬菌体展示文库的筛选技术[J]．生物技术通报，2005，4：36～38
[40] Parish D, Purohit A,Singh A,et al. Peptide inhibition of cytokine2stimu-lated aromatase activity in breast tissue fibroblasts. J Steroid Biochem &Mol Biol,2001,79:165～172.
[41] 高学良，钱文，赵群飞．噬菌体展示技术的发展及应用[J]．生命的化学，2001，21(5)：432～433．
[42] 祝仁发，黄莉清，何后军等．噬菌体展示系统及筛选技术研究进展[J]．中国生物工程杂志，2005，(增)：23～26
[43] 王宪文，毕英佐，曹永长．噬菌体肽库技术的应用[J]．生物技术通讯，2004，15(5) 489～492
[44] Hartley O. The use of phage display in the study of receptors and their lignnds. J Recept Signal Transduct Res. 2002, 22 (1-4): 373～392
[45] Petrenko V. A, Vodyanoy V. J. Phage display for detection of biological threat agents. J Microbiol Methods. 2003, 53 (2): 253～262
[46] 应用噬菌体表面展示肽库快速筛选肽配体使用手册[Z]。 http://www.biofriendship.com.cn/jiesjuefangan/protoscript_man.pdf, 2007-3-24
[47] 王小平，刘彦仿．噬菌体表面展示技术[J]．生物学杂志，1999，16(5)：7～8
[48] 赵慧斌．噬菌体抗体库筛选技术[J]．临床检验杂志，2004，22(2)：146～148．
[49] 吕勇刚，窦科峰，吴昱彤等．大容量人乳腺癌单链抗体库的构建与初步鉴定[J]．现代肿瘤医学，2006，14(2)：129～131．
[50] 岳建华，潘秀珍，王长军等．EBV转化B型健康人B淋巴细胞构建噬菌体抗体库[J]．免疫学杂志，2006，22(1)：23～26．
[51] Sparks A.B, Quilliam L. A, Thorn J. M, et al. Identification and characterization of Src SH3 ligands from phage-displayed random peptide libraries. J Biol Chem. 1994, 269:23853～23856
[52] Deleo F. R, Yu L, Burritt J. B, et al. Mapping sites of interaction of p47-phox and flavocytochrome b with random-sequence peptide phage display libraries. Proc Natl Acad Sci. 1995, 92:7110～7114
[53] 余传信，朱荫昌，殷旭仁等．利用噬菌体展示技术筛选日本血吸虫模拟抗原表位[J]．中国血吸虫病防治杂志，2002，14(5)：334～337．
[54] 田旺，李正赫，曹学琳等．应用噬菌体随机肽库技术研究干扰素-α2b抗原表位[J]．中华微生物学和免疫学杂志，2005，25(7)：578-582．
[55] Motti C, Nuzzo M, Meola A, et al. Recognition by human sera and immunogenicity of HBsAg mimotopes selected from an M13 phage display library[J]. Gene, 1994,146: 191～198.
[56] 李鹏，赖卫华，陈雪岚等．盐酸克仑特罗ELISA试剂盒的研制[J]．食品科学，2006，296(27)：296～300
[57] 赖卫华，熊勇华，许扬等．应用胶体金试纸条快速检测的研究[J]．食品科学，2005，126(5)：204～207
[58] 刘祖勇．增加洗板次数对HBsAgELISA检测结果的影响[J]．中国输血杂志，2006，19(2)：135～136
[59] S.Gumber a, G. Eamensb, R.J.Whittington a*.Evaluation of a Pourquier ELISA kit in relation to agar gel immunodiffusion (AGID) test for assessment of the humoral immune response in sheep and goats with and without Mycobacterium paratuberculosis infection Veterinary Microbiology 115 (2006):91～101
[60] 邓省亮．1 黄曲霉毒素B_1胶体金免疫层析快速检测方法的研究 2 应用噬菌体展示肽库淘选黄曲霉毒素B_1模拟表位：[硕士学位论文]．南昌：南昌大学中德联合研究院，2006
[61] 王选年，杨艳艳，邢广旭等．盐酸克伦特罗单抗快速检测试剂盒的研制[J]．中国兽医学 报，2004，24(1)：75～78
[62] 赵明军，谌南辉，王平等．噬菌体展示三肽囊素模拟肽的研究[J]．中国预防兽医学报，2005，27(4)：277～282．
[63] 张扬．利用噬菌体展示肽库筛选和鉴定沙门氏菌09抗原的模拟表位[硕士学位论文]．扬州大学．2001，26～28
[64] 肖昌．应用噬菌体肽库鉴定猪瘟病毒E2蛋白抗原表位[硕士学位论文]．中国人民解放军军需大学．2002，32～34
[65] 张晖．利用噬菌体展示技术筛选Gal-1α，3-Gal的模拟肽[硕士学位论文]．浙江大学．2003，23～25
[66] 俞海青，顾晓波．交替洗脱法筛选高亲和力噬菌体肽[J]．生物技术通讯，2003，14(6)：499～516．
[67] Kotz J. D, Bond C. J, Cochran A. G. Phage-display as a tool for quantifying protein stability determinants. Eur J Biochem. 2004, 271(9): 1623～1629
[68] 刘仁荣．赭曲霉毒素A无毒酶联免疫吸附检测方法建立研究：[博士学位论文]．南昌：南昌大学中德联合研究院，2005