摘要
缺血性脑血管病是老年人常见病,随着老年人口的增多及老龄化社会的到来,发病人数将进一步增加。其病理基础与缺血后引起的神经元坏死和迟发性神经元死亡密切相关。其治疗主要是溶栓、应用神经保护剂(包括谷氨酸拮抗剂、钙通道阻滞剂等)、外科治疗等,虽然取得了一定疗效,但因缺乏满意效果或安全性使其临床应用受到限制。新的神经保护剂正在试验中。
中医认为正虚血瘀,浊毒内蕴是老年缺血性卒中发生的前提,肝风旋动,挟浊毒损伤脑络是老年脑缺血损伤的发展的关键;解毒降浊、益气活血法是治疗老年脑缺血/再灌注损伤的主要方法。
而目前中医药、西医药及中西医结合方法防治缺血性脑血管病的实验研究中多以青年动物为对象,忽视了人类脑血管疾病中增龄因素的重要性。这对于探讨老年缺血性脑血管病病理生理特点及用于指导临床防治方面有一定的差距。因此,本课题以老龄大鼠脑缺血/再灌注后神经细胞凋亡的特征、细胞凋亡调控基因表达变化及其与中医气虚血瘀,浊毒损络的关系为研究的切入点,用“益气活血”、“解毒降浊”的脑脉通进行干预以阻断缺血损伤因果转换、恶势循环,保护神经细胞。采用大脑中动脉栓塞(线栓)致缺血3h、再灌注3 h、6h、12h、24h、72h为模型,用病理形态学、免疫组织化学法、免疫荧光法、分子生物学技术等实验方法,从整体、细胞、分子、基因表达水平上,动态观察不同时间点青年与老龄大鼠脑缺血/再灌注后神经细胞凋亡的特征及凋亡调控基因表达的异同,并进一步研究了脑脉通对老年脑缺血/再灌注后神经细胞凋亡及凋亡调控基因表达的影响。主要实验内容与结果如下。
1 老龄大鼠脑缺血/再灌注后神经细胞凋亡特征及脑脉通的保护作用
应用整体观察包括神经功能评分、脑组织含水量、梗塞面积等及一般形态学方法包括HE染色、尼氏染色、透射电镜,琼脂糖凝胶电泳等技术对比研究了老龄与青年大鼠脑缺血/再灌注后不同时间点整体和形态学变化特征的异同及脑脉通对其影响。结果发现老龄大鼠容易遭受缺血/再灌注损伤, 其损伤出现的时间早,损伤程度重,缺血损伤后梗塞面积大,其损害可随着缺血及再灌注时间的延长而加重,凋亡细胞数、凋亡小体呈现先少再多后少的变化规律,坏死细胞数随再灌注时间延长而增加。缺血性损伤发生不可逆时,在损伤中心区有坏死细胞增多,凋亡细胞减少,这些特征可能与增龄导致的细胞衰老有关。脑脉通中、大剂量可明显改善脑缺血/再灌注所致的神经元损伤,表现为改善神经功能、减轻脑组织含水量、缩小梗塞面积、减轻神经细胞损伤,保护神经元。其可能机理是合成自身修复所需的内源性蛋白,从而有利于神经元的修复;或可保护神经胶质细胞及血管内皮细胞,上调星形胶质细胞的活化状态,而有利于神经元的修复。这些作用可能与其益气扶正,解毒降浊的作用有关。
2 老龄大鼠脑缺血/再灌注后神经细胞凋亡基因表达的变化及脑脉通对其调节作用。
在取得上述结果的基础上,进一步应用免疫组织化学法、免疫荧光法、分子生物学等实验方法,动态观察了不同时间点青年与老龄大鼠脑缺血/再灌注后神经细胞凋亡调控基因表达的异同及脑脉通对其影响。结果如下。
2.1 老龄大鼠脑缺血/再灌注后细胞膜Fas、Fasl的表达及脑脉通的作用
脑缺血后Fas、Fasl均在缺血后注定死亡的细胞上表达,以半暗带区表达最强,缺血中心区及周边区亦可见弱表达; Fas、Fasl均随再灌注时间的延长而表达增强。老龄大鼠Fas、Fasl表达的增强时间均较青年大鼠早,其高表达持续时间较长。脑脉通解毒降浊,可以下调Fas、Fasl的表达,从而抑制细胞凋亡的发生,其效果等同于尼莫地平。
2.2 老龄大鼠脑缺血/再灌注后细胞浆Bcl-2、Bax的表达及脑脉通的作用
老年脑缺血后Bcl-2可见弱阳性表达,但其表达无时间规律性。青年大鼠脑缺血后Bcl-2均呈全脑性的增高,以缺血损伤侧为强,并随着缺血时间的延长先升后降,至再灌注72h时与假手术组比较无明显差异,其与缺血后细胞凋亡成负相关。青年或老龄大鼠脑缺血/再灌注后诱发Bax持续表达, 其表达与细胞凋亡成正相关。老龄大鼠Bax表达的增强时间及高峰时间均较青年大鼠早,其高表达持续时间较长。Bcl-2是抑制凋亡的基因,Bax是促进凋亡的基因,表达Bcl-2的细胞其形态多正常,表达Bax的细胞其形态多异常。老年脑缺血再灌注后Bcl-2的低表达或不表达及Bax的早表达和高表达可能与增龄导致的内源性保护能力降低有关,从而使老年脑缺血后神经元损伤较青年大鼠重。
脑脉通益气扶正,解毒降浊可以上调Bcl-2的表达,抑制Bax基因表达,对缺血神经元有保护作用。其对缺血前期的保护效应等同于尼莫地平,晚期的保护效应优于尼莫地平。
2.3 老龄大鼠脑缺血/再灌注后细胞核caspase-3活性变化及脑脉通的作用
Caspase-3是缺血后神经细胞凋亡的关键蛋白酶,其活性变化与缺血后神经元凋亡密切相关。 caspase-3的激活位于Fas、Fasl的下游。老龄大鼠缺血/再灌注后 caspase的激活早于青年大鼠。本实验显示应用脑脉通可降低脑缺血/再灌注后
脑组织caspase-3的活性,说明脑脉通可能通过作用于caspase-3前酶或调节其上游基因的表达,抑制其激活;或直接抑制caspas
Cerebral ischemia is a common disease in old people. Morbidity has been rising progressively along with the increase of the aged people and the coming of senile society. The pathophysiological mechanism of cerebral ischemia disease is related with necrosis and delayed neuronal death after cerebral ischemia reperfusion. Thrombolysis, neuro-protective drugs (including glutamic acid antagonist, Ca2+ pathway blocker etc) and surgical treatment are applied , but their protective effect is unsatisfactory. Though we have already got some research results, there is still lacking of data about its safety. Their application in clinic, therefore, is limited. The new neuro-protective drugs are still in its experimental stage.
Traditional Chinese medical theory think that blood stasis due to deficiency of Qi and Toxic materials in blood are the basic mechanism of cerebral I/R. The key factor is that the brain microvascular is impaired by the liver-feng due to toxic materials. Reinforcing genuine Qi, removing stagnaion of blood and getting rid of pathogenic factors are important therapies for cerebral ischemia reperfusion in the aged people.
At present, only young animals, instead of old ones, are used to study the mechanism of brain impairment after cerebral I/R. Obviously, it isn't reasonable because of the key factor of aging is ignored. Some efforts have to be made before release of its pathophysiological mechanism and guide to protection of neurocyte and treat disease.
1. The nature of neurocyte apoptosis after cerebral ischemia and I/R in the aged rats and the protective effect of Naomaitong
This study are reported that ischemia apoptotic cell death of neurons was delayed in the aged SD rats. Age-related changes in the process of neuronal death following acute focal cerebral I/R were studied. The young (4~5 months old) and the aged (20~21 months old) were compared by observation (including oedema by wet-dry/wet, infarct size etc.). This project also employed morphology (including hematoxylin-eosin stain, Nissl stain, electronic microscope etc.), in situ nick-end labeling (TUNEL method) and electrophoresis techniques. The results showed that the infarct size induced by I/R in the brain of aged rats was larger than that of the young, furthermore, the damage area (size and degree) expanded along with the increased extent of ischemia and the prolonged time of reperfusion. Oedema of brain in aged rats induced by I/R demonstrated that no age-related change in the early stage. But the mount of water being taken into brain in the aged rats was significantly greater than in the young with the prolonged time of reperfusion. The degree of brain's damage was also increased with increasing time of reperfusion. The number of
apoptotic cell and apoptotic body changed from time to time. There was a little in the early stage, a lot in the middle stage and a little in the late stage. Necrotis cells rose with time of I/R. This character could be related with aging cells due to the increasing age factor.
Naomaitong and Nimodipine could decrease oedema of the brain, diminish the infarct size and improve synhochrome of neuro-damage induced by I/R and reduce histological damage, protect neuron ultrastructure, including to decrease swollen mitochondria and enhance activation of glial cells etc.
2. The changes of gene expression of apoptotic cell after I/ R in the aged rats and the protective effect of Naomaitong
This research employed immunohistochemistry, biochemistry and molecular biology techniques to observe dynamically the changes of apoptotic regular gene expression at the different time-point (3h, 6h, 12h, 24h and 72h of MCAO). We measured the brain of 4~5 month-old and 20~21 month-old rats subject to ischemia and reperfusion. Neuro-protective effect of Naomaitong was studied at the same time.
2.1. Age-related changes of gene expression of Fas and Fas1 after I/R and neuro-protective effect of Naomaitong
The results showed that gene expression of Fas and Fas1 after I/R happened in all ischemic brain of ra
引文
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