胆红素氧化酶的分离纯化及其性质的研究
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摘要
露湿漆斑菌发酵4天后，从发酵液中通过盐析、透析浓缩、SephadexG—100凝胶柱层析，分离纯化出胆红素氧化酶，通过SDS-聚丙烯酰胺电泳鉴定，显示为一条带，分子量为68kDa左右。通过紫外诱变选育到两株产酶能力稍高的菌株，其产酶能力是原先的1.5～2倍。该酶在37℃以胆红素为底物的Km值为150μmol／L，最适反应温度为50℃，从60℃开始酶的稳定性变差。该酶在pH7.5时酶促反应最快，酸碱稳定性较高，金属离子对酶促反应有很大影响，EDTA、尿素等能提高酶促反应。利用胆红素氧化酶可用来测定胆红素含量，进行总胆红素测定实验时表明该酶用于诊断具有线性范围较宽、准确性和精密度都较好，可为黄疸等肝胆疾病的诊断提供可靠的依据。
Having been cultured 4 days in potato culture medium, Bilirubin oxidase(BOX) is purified from the culture filtrate of Myrothecium roridum after 4 days. The purified enzyme is obtained by the SephadexG-100 column chromatography. It shows a homogenous stain on the gel of SDS-PAGE. After treated by UV, two mutant strains with high yield of bilirubin oxidase are obtained. The molecular weight of the enzyme is about 68kDa. its optimum temperature is 50℃ and its optimum pH is 7.5. Metal ions have effect on its activity, EDTA and Urea can improve its activity and improve the stability of substrate. This enzyme can oxidaze bilirubin to biliverdin and further to an unknown substance, so it can be used to determine the bilirubin in serum in the clinical field. As an analytical tool, it has a wide line range and is accurate and exact.
Having been cultured 4 days in potato culture medium, Bilirubin oxidase(BOX) is purified from the culture filtrate of Myrothecium roridum after 4 days. The purified enzyme is obtained by the SephadexG-100 column chromatography. It shows a homogenous stain on the gel of SDS-PAGE. After treated by UV, two mutant strains with high yield of bilirubin oxidase are obtained. The molecular weight of the enzyme is about 68kDa. its optimum temperature is 50℃ and its optimum pH is 7.5. Metal ions have effect on its activity, EDTA and Urea can improve its activity and improve the stability of substrate. This enzyme can oxidaze bilirubin to biliverdin and further to an unknown substance, so it can be used to determine the bilirubin in serum in the clinical field. As an analytical tool, it has a wide line range and is accurate and exact.
引文
1 罗明典．现代生物技术极其产业化．复旦大学出版社，2001。
2 金晓红，王波．生物技术在医药领域中的研究与应用．医药导报，2002，21(8)：509-510
3 邢梦龙．生物诊断试剂的进展．上海医药信报研究，1997(2)
4 罗侃，崔有宏．诊断用酶的研究进展．西北国防医学杂志2000，2l(1)57-59
5 徐贵祥．一种潜在的治疗严量黄疸的药物胆红素氧化酶．国外医学药学分册，1991，18(3)：164-167
6 郭健，莫培生．胆红素氧化酶法测定血清结合胆红素．中华医学检验杂志，1994，7(5)：274
7 曾容珍．新生儿黄疸防治研究新动态．国外医学妇幼保健分册，1996，7(1)：1-3
8 沈定树．胆红素与心血管疾病．国外医学临床生物化学与检验学分册，2002，23 (6)：329-330
9 程小云．血清胆红素与糖尿病肾病关系初探．海南医学，2002，13(8)：43-44
10 宋克征．胆红素及检测方法研究的进展．国外医学临床生物化学与检验学分册，2002，23(5)：283-284
11 杨帆等．胆红素氧化酶法测定血清胆红素的方法学评价．当代医师杂志，1997，2(10)23-24
12 Fossati P, Ponti M, Prencipe L, Tarenghi G. One-step protocol for assasy of total and direct bilirubin with table combined reagents. Clin Chem, 1989,35(1):173
13 朴龙洙，金宝渊．胆红素测定方法的研究概况．延边医学院学报，1994，17(1)：62-66
14 张建新．改良J-G法测定血清直接胆红素的数学校正．分析化学，1998，26(7)：872-875
15 邱谷，任建兵．改良J-G法测定血清总胆红素在自动生化分析仪上的应用．临床检验杂志，2001，19(4)：229
16 王银改，刘红霞．血清胆红素改良J-G法自动化测定方法探讨．河南医药信息，2001．9(6)：35-36
17 Tokuda K, Tanimotok. A new method of measuring bilirubin in serum by Vanadic acid. Jpn J Clin Chem (in Japanes with English abstract), 1993,22: 116—122.
18 孙国华．钒酸盐氧化法测定血清胆红素的方法学评价．大连医科大学学报，2002，
24(3)：203-204
19 马荣红．钒酸盐氧化法测定血清总胆红素、直接胆红素的方法评价．江西医学检验，2002，20(2)：93-95
20 陈筱菲．钒酸氧化法测定血清总胆红素和结合胆红素．临床检验杂志，1999，17(6)：340-341
21 孙振荣．钒酸氧化法测定血清总胆红素评价．上海医学检验杂志，1999，14(2)：78-79
22 李之珍．钒酸氧化法与J-G法、重氮试剂法测定血清胆红素的比较．江西医学检验，1999，17(1)：25-26
23 Kurosaka K,Senba S, Tsubota H, et al. A new enzymatic assay for selectively measuring conjugated bilirubin concentration in serum with use of bilirubin oxidase. Clin Chem Acta, 1998, 269: 125-136.
24 Doumas BT, Yein F, Perry B, et al. Determination of the Sum of bilirubin suggar conjugates in plasma by bilirubin oxidase. Clin Chem, 1999, 45:1255.71260.
25 Morimoto Y, Ishtnar T, Takayma M, et al. Novel assay for measuring serum conjugated bilirubin and its Clinical relevance. J Clinical Laboratary Analysis, 2000, 14:27-31
26 刘宏．国产胆红素氧化酶测定血清总胆红素．中华医学检验杂志，1991，14(6)：322
27 王菊君．血清胆红素的酶法定量分析．生物化学杂志，1991，7(4)：507-509
28 周永列．酶法测定血清总胆红素．上海医学检验杂志，1991，6(3)：158-159
29 许国荣．血清结合胆红素的酶法测定．临床检验杂志，2000，18(6)：325-326
30 胡永翔．胆红素酶法测定的质量评价．现代临床医学生物工程学杂志，2000，6(4)：308-309
31 Brodersen R. et al .Eur. J. Biochem, 1969,10:468
32 S. Murao and N. Tanaka; Isolation and identification of a microorganism producing Bilirubin oxidase Agric. Biol. Chem, 1981,45:2031-2034
33 Tanaka, N. et al.: Agric. Biol. Chem, 1982,46:2499
34 Wu TW: Biochem Cell Biol 1988, 66(4): 1248
35 Satoshi Koideda. et al. Molecular Cloning of the Gene for Bilirubin Oxidase from Myrothecium verrucaria and Its Expression in Yeast. J. Biological Chem, 1993,268(25): 18801-18809
36 郭健等．胆红素氧化酶产酶菌株的分离及最佳产酶条件的研究．微生物学报，
1991，31(2)：156-159
37 张淑贤，苏风岩等．产胆红素氧化酶菌种筛选．微生物学杂志，1991，11(11)：16-19
38 潘彬，金建中等．胆红素氧化酶的纯化及某些性质的研究．8-11
39 王菊君，曹恩华，赵英霞．疣孢漆斑菌(Myrothecium Verrucaria)J-1胆红素氧化酶的纯化及性质初步研究．生物化学杂志，1991，7(6)：662-666
40 胡军，杨军艳．胆红素氧化酶产生菌的选育及发酵工艺条件的研究．食品与发酵工业，23(2)：22-27
41 TanakaN. et al. Ibid, 1982, 46(10): 2499
42 Yasumasa G. et al. J. Biochem, 1989, 106(4): 621
43 Yuji Seki. et al. Purification and properties of bilirubin oxidase from Penicillium janthinellum. J. Biotechnology, 1996,46:141-151
44 Yuji Seki. et al. Abnomal effect of mercury ions on bilirubin oxidase activity. J. Mol. Catal., A: Chemical, 96, L11
45 Kimura M. et al. Proc Soc Exp Biol Med, 1998,188(3): 364
46 Kazuhiro S. et al. Agaric Biochem Biophys Acta, 1989,991(3): 405
47 Toshinori Kamisako. et al. Polyethylene glycol-modified bilirubin oxidase improves hepatic energy charge and urinary prostaglandin levels in rats with obstructive jaundice. J.Hepatology, 1998,29:424-429
48 Lavin A. et al. Science 1985, 230(4725): 543
49 Satoshi Koikeda. et al. Molecular Cloning of the Gene for Bilirubin Oxidase from Myrothecium verrucaria and Its Expression in Yeast. J. Biolocical Chem, 1993, 268(5): 18801-18809
50 Stsushi Shimizu. Myrothecium verrucaria Bilirubin Oxidase and Its Mutants for Potential Copper Ligands. Biochem, 1999, 38, 3034-3042
51 Takeshi sakurai. et al. Construciton of a new expression system of bilirubin oxidase and, its mutants to explore the dioxygen reducion mechanism. J. Inorganic Biochem, 2003,96:223
52 王孔庆．提高胆红素标准液稳定性的方法．齐齐哈尔医学院学报，2001，22(3)：342-343
53 瞿卫等．用胆红素氧化酶两点法测定血清直接胆红素．临床检验杂志，1995，13(5)：256-257
2 金晓红，王波．生物技术在医药领域中的研究与应用．医药导报，2002，21(8)：509-510
3 邢梦龙．生物诊断试剂的进展．上海医药信报研究，1997(2)
4 罗侃，崔有宏．诊断用酶的研究进展．西北国防医学杂志2000，2l(1)57-59
5 徐贵祥．一种潜在的治疗严量黄疸的药物胆红素氧化酶．国外医学药学分册，1991，18(3)：164-167
6 郭健，莫培生．胆红素氧化酶法测定血清结合胆红素．中华医学检验杂志，1994，7(5)：274
7 曾容珍．新生儿黄疸防治研究新动态．国外医学妇幼保健分册，1996，7(1)：1-3
8 沈定树．胆红素与心血管疾病．国外医学临床生物化学与检验学分册，2002，23 (6)：329-330
9 程小云．血清胆红素与糖尿病肾病关系初探．海南医学，2002，13(8)：43-44
10 宋克征．胆红素及检测方法研究的进展．国外医学临床生物化学与检验学分册，2002，23(5)：283-284
11 杨帆等．胆红素氧化酶法测定血清胆红素的方法学评价．当代医师杂志，1997，2(10)23-24
12 Fossati P, Ponti M, Prencipe L, Tarenghi G. One-step protocol for assasy of total and direct bilirubin with table combined reagents. Clin Chem, 1989,35(1):173
13 朴龙洙，金宝渊．胆红素测定方法的研究概况．延边医学院学报，1994，17(1)：62-66
14 张建新．改良J-G法测定血清直接胆红素的数学校正．分析化学，1998，26(7)：872-875
15 邱谷，任建兵．改良J-G法测定血清总胆红素在自动生化分析仪上的应用．临床检验杂志，2001，19(4)：229
16 王银改，刘红霞．血清胆红素改良J-G法自动化测定方法探讨．河南医药信息，2001．9(6)：35-36
17 Tokuda K, Tanimotok. A new method of measuring bilirubin in serum by Vanadic acid. Jpn J Clin Chem (in Japanes with English abstract), 1993,22: 116—122.
18 孙国华．钒酸盐氧化法测定血清胆红素的方法学评价．大连医科大学学报，2002，
24(3)：203-204
19 马荣红．钒酸盐氧化法测定血清总胆红素、直接胆红素的方法评价．江西医学检验，2002，20(2)：93-95
20 陈筱菲．钒酸氧化法测定血清总胆红素和结合胆红素．临床检验杂志，1999，17(6)：340-341
21 孙振荣．钒酸氧化法测定血清总胆红素评价．上海医学检验杂志，1999，14(2)：78-79
22 李之珍．钒酸氧化法与J-G法、重氮试剂法测定血清胆红素的比较．江西医学检验，1999，17(1)：25-26
23 Kurosaka K,Senba S, Tsubota H, et al. A new enzymatic assay for selectively measuring conjugated bilirubin concentration in serum with use of bilirubin oxidase. Clin Chem Acta, 1998, 269: 125-136.
24 Doumas BT, Yein F, Perry B, et al. Determination of the Sum of bilirubin suggar conjugates in plasma by bilirubin oxidase. Clin Chem, 1999, 45:1255.71260.
25 Morimoto Y, Ishtnar T, Takayma M, et al. Novel assay for measuring serum conjugated bilirubin and its Clinical relevance. J Clinical Laboratary Analysis, 2000, 14:27-31
26 刘宏．国产胆红素氧化酶测定血清总胆红素．中华医学检验杂志，1991，14(6)：322
27 王菊君．血清胆红素的酶法定量分析．生物化学杂志，1991，7(4)：507-509
28 周永列．酶法测定血清总胆红素．上海医学检验杂志，1991，6(3)：158-159
29 许国荣．血清结合胆红素的酶法测定．临床检验杂志，2000，18(6)：325-326
30 胡永翔．胆红素酶法测定的质量评价．现代临床医学生物工程学杂志，2000，6(4)：308-309
31 Brodersen R. et al .Eur. J. Biochem, 1969,10:468
32 S. Murao and N. Tanaka; Isolation and identification of a microorganism producing Bilirubin oxidase Agric. Biol. Chem, 1981,45:2031-2034
33 Tanaka, N. et al.: Agric. Biol. Chem, 1982,46:2499
34 Wu TW: Biochem Cell Biol 1988, 66(4): 1248
35 Satoshi Koideda. et al. Molecular Cloning of the Gene for Bilirubin Oxidase from Myrothecium verrucaria and Its Expression in Yeast. J. Biological Chem, 1993,268(25): 18801-18809
36 郭健等．胆红素氧化酶产酶菌株的分离及最佳产酶条件的研究．微生物学报，
1991，31(2)：156-159
37 张淑贤，苏风岩等．产胆红素氧化酶菌种筛选．微生物学杂志，1991，11(11)：16-19
38 潘彬，金建中等．胆红素氧化酶的纯化及某些性质的研究．8-11
39 王菊君，曹恩华，赵英霞．疣孢漆斑菌(Myrothecium Verrucaria)J-1胆红素氧化酶的纯化及性质初步研究．生物化学杂志，1991，7(6)：662-666
40 胡军，杨军艳．胆红素氧化酶产生菌的选育及发酵工艺条件的研究．食品与发酵工业，23(2)：22-27
41 TanakaN. et al. Ibid, 1982, 46(10): 2499
42 Yasumasa G. et al. J. Biochem, 1989, 106(4): 621
43 Yuji Seki. et al. Purification and properties of bilirubin oxidase from Penicillium janthinellum. J. Biotechnology, 1996,46:141-151
44 Yuji Seki. et al. Abnomal effect of mercury ions on bilirubin oxidase activity. J. Mol. Catal., A: Chemical, 96, L11
45 Kimura M. et al. Proc Soc Exp Biol Med, 1998,188(3): 364
46 Kazuhiro S. et al. Agaric Biochem Biophys Acta, 1989,991(3): 405
47 Toshinori Kamisako. et al. Polyethylene glycol-modified bilirubin oxidase improves hepatic energy charge and urinary prostaglandin levels in rats with obstructive jaundice. J.Hepatology, 1998,29:424-429
48 Lavin A. et al. Science 1985, 230(4725): 543
49 Satoshi Koikeda. et al. Molecular Cloning of the Gene for Bilirubin Oxidase from Myrothecium verrucaria and Its Expression in Yeast. J. Biolocical Chem, 1993, 268(5): 18801-18809
50 Stsushi Shimizu. Myrothecium verrucaria Bilirubin Oxidase and Its Mutants for Potential Copper Ligands. Biochem, 1999, 38, 3034-3042
51 Takeshi sakurai. et al. Construciton of a new expression system of bilirubin oxidase and, its mutants to explore the dioxygen reducion mechanism. J. Inorganic Biochem, 2003,96:223
52 王孔庆．提高胆红素标准液稳定性的方法．齐齐哈尔医学院学报，2001，22(3)：342-343
53 瞿卫等．用胆红素氧化酶两点法测定血清直接胆红素．临床检验杂志，1995，13(5)：256-257