脾气虚证患者线粒体DNA多态性与超微结构的初步研究
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摘要
目的：对脾气虚证患者十二指肠粘膜线粒体DNA(mtDNA)全序列与线粒体超微结构进行初步探讨，了解脾气虚证与线粒体DNA多态性的相关性。
方法：参照已经界定的排除标准，选择病例；分脾气虚证组、湿热证对照组和正常对照组；对十二指肠粘膜的超微结构在电镜下进行观察；提取并扩增线粒体DNA，行mtDNA全序列测定，对结果先BLAST，与剑桥序列进行比对，记录突变位点、突变种类、突变性质、合成氨基酸的密码子改变情况，利用Olige6.0软件进行多基因序列比对分析，了解线粒体的多态性。
结果：1、脾气虚证和湿热证线粒体的结构均有不同程度的改变；其中同一种疾病，脾气虚证组与湿热证组线粒体结构的改变无明显差异：而同一种证型，慢性浅表性胃炎组与十二指肠球部溃疡组线粒体的改变差异明显，慢性浅表性胃炎组线粒体的改变较轻，十二指肠球部溃疡组线粒体的改变明显；脾气虚证十二指肠球部溃疡组的线粒体有明显的肿胀，变形，嵴减少或消失，有些线粒体有空泡形成，湿热证球部溃疡组线粒体也有肿胀、变形、嵴减少或消失等改变，还有些聚集在一起。2、对11个标本进行了mtDNA全序列重叠测序，测出率达99％，每个序列分正向和反向测序两次，有些序列多次重复检测，结果稳定。3、重叠测序后共检测出碱基突变470个。突变类型有：单个碱基突变和多个碱基突变，每种突变又包括碱基置换、碱基插入、碱基缺失：其中D-LOOP区断共64个，t—RNA区段共53个，r—RNA段共77个，CDS段共276个。脾气虚证组和慢性浅表性胃炎在D-LOOP区突变率高于其他组，脾气虚证和湿热证十二指肠球部溃疡组缺失突变高于其他组。4、移码突变共107个，碱基置换突变共314个(包括同义突变83个，错义突变261个，无义突变15个)。脾气虚证在同义、错义、无义和移码突变均等同或低于湿热证；湿热证在错义和移码突变中突变数明显增高；慢性浅表性胃炎组在同义突变中突变多，球部溃疡组在错义、无义和移码突变中突变多于其他组；脾气虚证组在转换、颠换方面均低于湿热证组；脾气虚证和湿热证球部溃疡组在插缺方面突变明显高于其他组。
结论：1、同一证型(脾气虚证)不同病种(慢性浅表性胃炎和十二指肠球部溃疡)线粒体超微结构的改变不相同；2、脾气虚证mtDNA序列存在多态性改变；3、脾气虚证慢性浅表性胃炎组在D-LOOP区突变率高，可能是脾气虚证的分子基础；4、脾气虚证和湿热证的十二指肠球部溃疡组插入和缺失突变明显高于慢浅胃组和正常组，可能是十二指肠球部溃疡的分子基础。
Aim: To explore the whole genome sequence and ultrastructure ofmitochondrion in duodenum mucosa from spleen qi-deficiency syndrome's patient.To understand the relations between spleen qi-deficiency and polymorphismsof mitochondrial DNA (mtDNA).
Method: Refer to having bordered the exclusive standard to choose caseswhich are divided into spleen qi-deficiency syndrome group、the wet and hotsyndrome group and normal contrastive group.By electron microscope to observethe ultrastructure of mitochondrial in duodenum mucosa. To extract andextend-prolifer mtDNA, to blast the result, to contrast with Cambridgesequence. Record the mutation Site、type、character and cipher code whichsynthesize amino acid. To understand the mtDNA's polymorphisms, make use ofOlige 6.0 software to analyse the multi-gene sequence.
Result: 1 There are different degree's change in all groups. Nodifference is found between Spleen qi-deficiency syndrome and the wet and hotsyndrome group with same disease; there are obvious different between chronicshallow gastritis(CSG) and duodenum ulcer with same syndrome; CSG's changesare lighter and duodenum ulcer's changes are obviously more. Somemitochondrion swells, metamorphosis, which ridge become less, even vanish forduodenum ulcer of Spleen qi-deficiency syndrome, Some mitochondrion becomehollow; the wet and hot syndrome group's changes are like this, somemitochondrion get together. 2 The eleven samples are surveyed for the wholemtDNA sequence, the complete rate is 99%; every sequence is measured frompositive and negative two directions, some are several times, the result issteady. 3 There are 470 mutation after repeat measure. The mutation typeshave single and multi-nucleotide mutation, every mutation still includeexchange、insert and defect, there are 64 mutations in D-LOOP section, 53 mutations in t-RNA section, 77 mutations in r-RNA section, 276 mutations inCD section. The mutations are more in D-LOOP section from Spleenqi-deficiency syndrome and CSG. The defect mutations are more in duodenum ulcer.4 The alter code's mutations are 107, nucleotide exchange mutations are 314(same meaning mutations are 83, fault meaning mutations are 26, losing meaningmutations are 15), same meaning mutations、fault meaning mutations、losingmeaning mutations and alter code's mutations are less in Spleen qi-deficiencysyndrome than other's groups; fault meaning mutations and alter code'smutations are more in the wet and hot syndrome group than other's groups;same meaning mutations are more in CSG; fault meaning mutations、losingmeaning mutations and alter code's mutations are more in duodenum ulcer;transition and transversion are less in Spleen qi-deficiency syndrome group,insert and defect mutations are obviously more in duodenum ulcer group thanCSG group.
Conclusion: 1 The ultrastructure of mitochondrion are different fordifferent disease(CSG and duodenum ulcer ) with same syndrome (Spleenqi-deficiency syndrome or the wet and hot syndrome group); 2 Spleenqi-deficiency syndrome's mtDNA exist polymorphism; 3 The mutations are morein D-LOOP section from Spleen qi-deficiency syndrome, which is probably itsmolecule base. 4 Insert and defect mutations are obviously more in duodenumulcer group of Spleen qi-deficiency syndrome or the wet and hot syndrome group,which is probably its molecule base.
方法：参照已经界定的排除标准，选择病例；分脾气虚证组、湿热证对照组和正常对照组；对十二指肠粘膜的超微结构在电镜下进行观察；提取并扩增线粒体DNA，行mtDNA全序列测定，对结果先BLAST，与剑桥序列进行比对，记录突变位点、突变种类、突变性质、合成氨基酸的密码子改变情况，利用Olige6.0软件进行多基因序列比对分析，了解线粒体的多态性。
结果：1、脾气虚证和湿热证线粒体的结构均有不同程度的改变；其中同一种疾病，脾气虚证组与湿热证组线粒体结构的改变无明显差异：而同一种证型，慢性浅表性胃炎组与十二指肠球部溃疡组线粒体的改变差异明显，慢性浅表性胃炎组线粒体的改变较轻，十二指肠球部溃疡组线粒体的改变明显；脾气虚证十二指肠球部溃疡组的线粒体有明显的肿胀，变形，嵴减少或消失，有些线粒体有空泡形成，湿热证球部溃疡组线粒体也有肿胀、变形、嵴减少或消失等改变，还有些聚集在一起。2、对11个标本进行了mtDNA全序列重叠测序，测出率达99％，每个序列分正向和反向测序两次，有些序列多次重复检测，结果稳定。3、重叠测序后共检测出碱基突变470个。突变类型有：单个碱基突变和多个碱基突变，每种突变又包括碱基置换、碱基插入、碱基缺失：其中D-LOOP区断共64个，t—RNA区段共53个，r—RNA段共77个，CDS段共276个。脾气虚证组和慢性浅表性胃炎在D-LOOP区突变率高于其他组，脾气虚证和湿热证十二指肠球部溃疡组缺失突变高于其他组。4、移码突变共107个，碱基置换突变共314个(包括同义突变83个，错义突变261个，无义突变15个)。脾气虚证在同义、错义、无义和移码突变均等同或低于湿热证；湿热证在错义和移码突变中突变数明显增高；慢性浅表性胃炎组在同义突变中突变多，球部溃疡组在错义、无义和移码突变中突变多于其他组；脾气虚证组在转换、颠换方面均低于湿热证组；脾气虚证和湿热证球部溃疡组在插缺方面突变明显高于其他组。
结论：1、同一证型(脾气虚证)不同病种(慢性浅表性胃炎和十二指肠球部溃疡)线粒体超微结构的改变不相同；2、脾气虚证mtDNA序列存在多态性改变；3、脾气虚证慢性浅表性胃炎组在D-LOOP区突变率高，可能是脾气虚证的分子基础；4、脾气虚证和湿热证的十二指肠球部溃疡组插入和缺失突变明显高于慢浅胃组和正常组，可能是十二指肠球部溃疡的分子基础。
Aim: To explore the whole genome sequence and ultrastructure ofmitochondrion in duodenum mucosa from spleen qi-deficiency syndrome's patient.To understand the relations between spleen qi-deficiency and polymorphismsof mitochondrial DNA (mtDNA).
Method: Refer to having bordered the exclusive standard to choose caseswhich are divided into spleen qi-deficiency syndrome group、the wet and hotsyndrome group and normal contrastive group.By electron microscope to observethe ultrastructure of mitochondrial in duodenum mucosa. To extract andextend-prolifer mtDNA, to blast the result, to contrast with Cambridgesequence. Record the mutation Site、type、character and cipher code whichsynthesize amino acid. To understand the mtDNA's polymorphisms, make use ofOlige 6.0 software to analyse the multi-gene sequence.
Result: 1 There are different degree's change in all groups. Nodifference is found between Spleen qi-deficiency syndrome and the wet and hotsyndrome group with same disease; there are obvious different between chronicshallow gastritis(CSG) and duodenum ulcer with same syndrome; CSG's changesare lighter and duodenum ulcer's changes are obviously more. Somemitochondrion swells, metamorphosis, which ridge become less, even vanish forduodenum ulcer of Spleen qi-deficiency syndrome, Some mitochondrion becomehollow; the wet and hot syndrome group's changes are like this, somemitochondrion get together. 2 The eleven samples are surveyed for the wholemtDNA sequence, the complete rate is 99%; every sequence is measured frompositive and negative two directions, some are several times, the result issteady. 3 There are 470 mutation after repeat measure. The mutation typeshave single and multi-nucleotide mutation, every mutation still includeexchange、insert and defect, there are 64 mutations in D-LOOP section, 53 mutations in t-RNA section, 77 mutations in r-RNA section, 276 mutations inCD section. The mutations are more in D-LOOP section from Spleenqi-deficiency syndrome and CSG. The defect mutations are more in duodenum ulcer.4 The alter code's mutations are 107, nucleotide exchange mutations are 314(same meaning mutations are 83, fault meaning mutations are 26, losing meaningmutations are 15), same meaning mutations、fault meaning mutations、losingmeaning mutations and alter code's mutations are less in Spleen qi-deficiencysyndrome than other's groups; fault meaning mutations and alter code'smutations are more in the wet and hot syndrome group than other's groups;same meaning mutations are more in CSG; fault meaning mutations、losingmeaning mutations and alter code's mutations are more in duodenum ulcer;transition and transversion are less in Spleen qi-deficiency syndrome group,insert and defect mutations are obviously more in duodenum ulcer group thanCSG group.
Conclusion: 1 The ultrastructure of mitochondrion are different fordifferent disease(CSG and duodenum ulcer ) with same syndrome (Spleenqi-deficiency syndrome or the wet and hot syndrome group); 2 Spleenqi-deficiency syndrome's mtDNA exist polymorphism; 3 The mutations are morein D-LOOP section from Spleen qi-deficiency syndrome, which is probably itsmolecule base. 4 Insert and defect mutations are obviously more in duodenumulcer group of Spleen qi-deficiency syndrome or the wet and hot syndrome group,which is probably its molecule base.
引文
1、朱泉 中医证侯机理研究思路的反思现代医药卫生2005；21(20)：2816-2817
2、葛文松，刘杰民．中医脾虚证研究的误区与对策，贵阳中医学院学报，2004；26(1)：6-8
3、脾主运化与脾主肌肉的关系浅探 周俊亮 刘友章 潘奔前 实用中医内科杂志2006年；20(1)：17-18
4、杨维益，等．脾气虚证大鼠骨骼肌的形态学和形态计量研究[J]．中国运动医学杂志1993；12(3)：157
5、李乐红，等．“脾气虚”大鼠骨骼肌细胞化学研究[J]．中国医药学报1990：5(5)：16
6、王淑娟，马铁明，张立德．脾气虚大鼠肌电图及运动神经传导速度的变化研究[J]．辽宁中医杂志，1998；25(9)：441
7、周平祯，秦小珑，宋军福．脾主肌肉与．K+、Na+、Cl—关系的探讨[J]．江西中医药1995； 6(增刊)：4-5
8、贾钰华，徐复霖，许俊杰，等．脾虚证的微循环和血液流变学同步观察[J]．中医药研究，1991；(6)：55．
9、刘志宏，张桂菊，倪育淳，等．脾肺气虚证与微观血瘀证的相关性分析[J]．中国中医药信息杂志，2001：8(1)：45．
10、章梅，夏天，南耘，等．脾虚患者血浆纤维连接蛋白和巨噬细胞功能的变化[J]．浙江中医学院学报，1999；23(5)：36．
11、沈华，关崇芬 脾虚证的临床和实验免疫研究进展[J]．中国中医基础医学杂志1997；3(3)：57
12、万集今 实验性脾虚小鼠脾脏淋巴细胞增殖周期和免疫细胞化学的研究[J]．中国组织化学与细胞化学杂志1994；3(2)：116
13、刘健，孙弼纲脾虚泄泻患者红细胞免疫功能的临床研究[J]．中国中西医结合杂志1994：14(9)：531
14、章梅，夏天，张仲海．脾虚小鼠红细胞免疫和腹腔巨噬细胞吞噬功能改变的实验研究[J]．北京中医药大学学报，1999：22(3)：26．
15 匡调元，中医病理研究。第二板[M]。上海：上海科技出版社。1989：63
16、许琦，巫燕莉，王建华，等．“脾虚”大鼠经胃泌素刺激胃酸分泌的敏感性及补中益气汤的作用[J]．中药药理与临床，2002；18(5)：2
17、陈奇 中药药理研究方法学北京：人民卫生出版社，1996； 10：23
18、刘学松 利血平致动物脾虚模型机制的研究[J]．中国医药学报，1989；4(5)：6-7
19、陈小野 脾虚证动物模型的造模思路[J]．中医杂志，1993；35(4)：239
20、潘霜，朱智德，窦维华．脾虚证动物模型若干问题的探讨[J]．现代中西医结合杂志，2004：13(9)：1241～1242
21、陈小野，邹世洁，张智，等．大鼠长期脾虚造模的实验研究[J]．中国中医基础医学杂志，1995；1(1)：37～41
22、郭显椿，张生福，毛绍振，等．小白鼠脾虚证模型的复制及某些生理功能的试验观察[J]．中兽医医药杂志，2000；5：4
23、广州中医学院脾胃研究所脾虚患者唾液淀粉酶活性初步观察[J]中华医学杂志1980：60(5)：290
24、劳绍贤．脾虚证候的现代研究概论．新中医，1985：(9)：49
25、李常青 王建华 唾液淀粉酶、D—木糖排泄率和胃电图三者合参对脾虚证的研究[J]湖南中医学院学报1998；(2)：8
26、王建华，连志诚，侯宁脾胃病患者的中医辩证与胃电图检查结果关系的探讨[J]中医杂志1983 24(6)：26
27、脾虚大鼠壁细胞Ca~(2+)／CaM-PK Ⅱ活性的变化及黄芪的作用 张根水，王汝俊 唐惠琼[J]． 中药药理与临床2002；18(6)：19-20
28、脾虚大鼠胃壁细胞胃泌素受体研究及黄芪的作用观察张根水王汝俊[J]．中国中西医结合基础杂志2002；8(6)：44-46
29、脾虚大鼠胃壁细胞胞浆游离钙离子浓度及黄芪对其调节作用的研究 聂克，王汝俊[J]．中药药理与临床2001；17(2)：5—6
30、劳绍贤，赵瞻元，王建华，脾虚证胃肠粘膜线粒体研究及其临床意义，[J]。广州中医药大学学报1991；8(6)：24-25
31、程学仁，王建华，劳绍贤等，脾虚证患者十二指肠吸收细胞线粒体的观察。[J]．安徽中医学院学报，1999；18(5)：33-34
32、邓伟民，劳绍贤．脾虚证胃粘膜主、壁细胞线粒体立体计量学研究及临床意义，[J]．解放军医学杂志，1997；22(2)：130—131
33、李燕舞，王汝俊，王建华，大黄脾虚模型大鼠胃壁细胞的超微结构观察[J]．中国中西医结合消化杂志，2005；13(3)：155-157。
34、广州中医学院脾胃研究所四君子汤对动物离体小肠运动的影响(一)[J]。新中医，1978；(5)：53-54
35、王汝俊，王建华，邵庭荫等，补中益气汤“调理脾胃”的药理作用研究—对胃肠运动及小肠吸收的影响，[J]中药药理与临床1987；3(2)：4-5
36、黄玲，王建华，劳绍贤。党参、蒲公英、川芎及其配伍对胃粘膜损伤的保护作用[J]广州中医药大学学报，1992：9(1)：41
37、黄绍刚 周福生 黄穗平 脾虚瘀热病机在消化性溃疡中的意义[J]．中医杂志2006：47(10)：728—730
38、胡丽娟 周福生消化性溃疡复发机理的研究思路与方法[J]．中医药学刊2004； 22(1)：122-123
39、周福生 程宏辉 祝淑贞心胃相关理论及临床应用[J]浙江中医学院学报2004；28(2)：7-8
40、张庆宏，周福生。析“心胃相关”。[J]云南中医学院学报，2001；24(2)：38-39
41、周福生 许仕杰 黄纯美运用“周易思维”升华中医理论 [J]浙江中医学院学报2005；29(1)：5-8
42：许仕杰，黄纯美，周颖瑜周福生教授“血三脏”与胃肠功能性疾病的相关探讨[J]中医药学刊2005；23(1)：24-27
43：许仕杰，吴栓。周福生教授三脏一体辨证新模式的提出及临床运用[J]。中医药学刊，2004；5(5)：14～16
46、任平，黄熙，张莉 四君子汤对实验性脾气虚大鼠胃排空率的排空影响[J]．中国中西医结合杂志，2000；20(8)：596-597
47、李勇敏，彭淑珍，王福云。健脾消积液对胃肠功能的影响[J]．中国中医药信息杂志，2000；7(2)：21-22
48、崔琦珍，黄志新，劳绍贤等，慢性浅表性胃炎脾胃虚实证钡条胃排空影响[J]．中国中西医结合杂志。2000：20(8)：596-598
49、徐珊，杨青，成信法乐胃饮对脾气虚实验大鼠胃泌素和胃动素的影响[J]．中国医药学报，2004；19(1)：20-22
50、王兆清，程一饮，吴家驹等，“脾”与胃酸分泌功能的初探——附341例分析[J]．中西医结合杂志，1984；4(1)：36
51、金敬善。血清中胃泌素水平与脾气虚证的关系[J]．中国中西医结合杂志，1982：2(1)： 25
52、郑小伟，王颖，宋红，三种脾气虚证模型大鼠血清胃泌素及胃窦G细胞的比较研究[J]．中华中医药杂志，2006；21(6)：318-320
53、封吉化，尚虎虎，黄熙等。脾虚早期与脾虚期大鼠组织和血浆中SS、CCK、MOT含量变化的探讨[J]．中国人民武警医学杂志，2005；16(5)：336-339
54、刘芳，任平，李月彩等。脾气虚证与胆囊收缩素的关系[J]．中国中西医结合消化杂志，2002；10(5)：262-264
55、杨维益，梁嵘，陈家旭，等．脾气虚证与胰腺外分泌功能关系的临床研究[J]．中国中西医结合杂志，1996：16(7)：414
56、曲瑞瑶，曲柏林，曾文红，等．大鼠实验性脾虚证胃电波和胃运动波的研究[J]．中国中西医结合杂志，1994；14(3)：156．
57、郑樨年，黄玉芳，丁金芳，等．脾虚证胃痛与胃窦粘膜D细胞关系的探讨[J]．江苏中医，1990；11(1)：36．
58、裴瑗，李德新．脾阳虚大鼠横纹肌线粒体超微结构及血清肌红蛋白含量的实验研 究[J]．辽宁中医杂志，1991；18(5)：43．
59、李庆明，吴义芳，吴金浪，等．脾气虚证壁细胞线粒体，G细胞分泌颗粒与血清胃泌素，胃粘膜SOD、MDA的变化[J]．中山医科大学学报，1995；16(1)：45．
60、刘友章 脾胃气虚与肝胃不和型胃脘痛患者胃粘膜的扫面电镜观察[J]．广州中医学院学报。1988；(1)：16-19
61、周俊亮，潘佩光，潘奔前中医脾与线粒体的关系探讨[J]．中医药导报2006；12(2)：9-10
62、郑敏磷，中医藏象实质细胞生物学假说[J]．中医药学刊，2004；22(6)：1068-1070
63、李光辉，李锋，陈超等．川芎嗪对大鼠脊髓损伤后线粒体功能的保护作用[J]．中国中医急症，2005；14(10)：991-992
64、杨维益，梁嵘，文平，等．脾气虚证大鼠骨骼肌的形态学和形态计量研究[J]．中国运动医学杂志，1993；12(3)：157
65、魏彦明．脾虚证家兔胃、肠、肝、脾超微结构与微量元素含量[J]．甘肃农业大学学报，1995；30(1)：7
66、劳绍贤，赵瞻元，王建华，等．脾虚证胃肠黏膜线粒体研究及其临床意义[J]．广州中医学院学报，1991：8(4)：264
67、刘健，刘春丽，方朝晖，等．脾虚大鼠心肌细胞超微结构动态变化的实验研究[J]，中医研究，1996；9(6)：12．
68、刘健，刘春丽，方朝晖，等．脾虚大鼠肝细胞超微结构动态变化的实验研究[J]．辽宁中医杂志，1998；25(7)：333
69、季风清，王秀琴，史小林，等实验性脾虚证大鼠肾上腺形态学与细胞化学研究[J]．首都医科大学学报，1997；17(1)：25
70、尹光耀，何雪芬，尹玉芬，等．脾虚证患者胃黏膜线粒体超微结构、微量元素及相关因素的研究[J]．中国中西医结合杂志，1995；15(12)：719
71、陈玉琴 不同程度脾虚证患者甲状腺功能改变的临床研究[J]．安徽中医学院学报，1998；3(1)：10
72、许晴，路欣，史小林，等实验性脾虚证睾丸形态学与细胞化学的研究[J]．首都医科大学学报，1997；17(1)：21
73、魏彦明．脾虚证兔胃肠肝脾超微结构与微量元素含量[J]．甘肃农业大学学报，1995；30(1)：7—12
74、尹光耀，何雪芬，尹玉芬．脾虚证胃病胃粘膜亚细胞结构及其微量元素、DNA研究的临床意义[J]．中国中西医结合脾胃杂志，1996；4(1)：10—15
75、刘尽，曲长江，三种脾虚模型小鼠线粒体超微结构改变的比较研究。[J]中医药学刊，2001；19(4)378—379
76、吴煜，李玉波，尤江云。慢性胃炎脾胃气虚证气滞证与主壁细胞超微结构关系的 研究[J]。中国中西医结合杂志，1997；17(8)：477
77、祁建生，李秀娟，杨春波等，慢性胃炎脾虚证细胞游离Ca~(2+)及膜Ca~(2+)-Mg~(2+)-ATPase研究[J]中国中西医结合脾胃杂志，1999；7(1)：16-17
78、尹光耀，陈一，张武宁等，慢性胃炎脾虚证分型的病理生理学基础[J]，中国中西医结合基础医学杂志，2005；11(4)：298-301
79、Anderson S, Bankier AT, Barrell BG, et al . Sequence and organization of the human mitochondrial genome. Nature, 1981; 290:457
80、Andrews. R. M., Kubacka, I., Chinnery, P. F, et al Reanalysis and revision of the Cambridge reference sequence for human mitochondrial DNA,Nature Genetics 1999:23:147
81、Yakes FM, Van Houten B. Mitochondrial DNA damage is more extensive and Persists longer than nuclear DNA damage in human cells following oxidative stresst. Proc NatlAcad Sci USA, 1997: 94:514
82、Khadakov M, Heflich RH, Manjamatha MG, et al. Accumulation of point mutations in mitochondrial DNA of aging mice[J]. Muratres. 2003:526(1-2):1-7
83、周云丽，牛瑞芳，史玉荣，乳腺癌线粒体基因组控制区突变的研究，中华肿瘤防治杂志，2006；13(14)：1082-10848
84、Fliss MS, Usadel H, Caballero OL, et al. Facile detection of mitochondrial DNA mutations in tumors and bodily fluids [J] .Science, 2000; 287(5460):2017 2019.
85、Kamalidehghan B , Housmand M , Ismail P , et al. Deltemt DNA (4799) is more comman in non-tumoral cells from gastric cancer sample [J], Archmed Res.,2006:37(6):730-735
86、隋桂琴，王陆飞，王桂云LHON患者线粒体基因突变频谱分析中国实验诊断学2006：10(7)：759-762
87、Kaneda H, Hayashi J, Takahama S, et al. Elimination of pateral mitochonial DNA in intraspecific crosses during early mouse embryogenesis. Pre Nat Sci,1995: 92:4542-4546.
88、Galloway C D, Reyholds R L, Herrin G L, et al .The frequency of heteroplasms in tissue types and increase with age. Am J Num Cenet. 2000:66(4):1384-1397
89、余时沧，钱桂生，黄桂君，高蕾。 F16，一种以线粒体为靶点的抗癌分子， 《生命的化学》2004；24(5)：421-423
90、刘键，刘春丽，李平，等110例老年脾虚证的研究[J]．安徽中医学院学报，1996：1(1)：17
91、刘晓颖。脾气虚证与胃粘膜P53基因表达关系的实验研究[J]，中国中医基础医 学杂志，1999；5(3)：15-18
92、尹德辉，王彩霞，李德新等，脾阴虚证衰老模型大鼠的心肌和脑组织线粒体DNA缺失情况[J]，中国临床杂志，2006；10(35)：100-102
93、葛云松，刘杰民。中医脾虚证研究的误区与对策[J]．贵阳中医学院学报，2004；20(1)：6-8。
94、尹耀慧，易振佳，金益强，证侯基因组学深入研究的思考[J]．湖南中医杂志，2006；22(6)：1-3
95、许光照，脾气虚证患者十二指肠的病理形态及组织化学研究[J]．中西医结合杂志，1987：7(12)：722
96、邓伟民，脾虚证胃粘膜主壁细胞线粒体计量学研究及临床意义[J]．解放军医学杂志。1997；11(2)：130-131。
97、Sutourky P ,Morono R D, Ramalho-santos J, et al. Ubiquitin tag for sperm mitochondria. Nature, 1999: 402(6760): 371-372
98、Coller H A, Bedrak N D, Khrapko K. Frequent intracellular clonal expansions of somatic mtDNA mutations significance and mechanisms. Ann Y Acad Sci. 2002;959:434-447
99、Rokes A, Ladoukakis E D, Iouros E. Animal mitochondrial DNA recombination revisited. Trands in Ecology and Evolution. 2003:18:411-417
100、赵兴波，储明显，李宁等，绵羊线粒体DNA的父系遗传。中国科学(C辑)，2000；30(6)： 642-646
101、Awadalla P, Zyre-Walker A, Smith J M. Linkage disequilibrium and recombination in hominial mitochondrial DNA. Science. 1999 ; 286 (5449) :2524-2525
102、Reynier B ,Malthiery Y.A.ccumulation of deletions in mtDNAduring tissue aging: Analysis by long PCR. Beochem Biophys Res Common, 1995: 217(1):59-67
2、葛文松，刘杰民．中医脾虚证研究的误区与对策，贵阳中医学院学报，2004；26(1)：6-8
3、脾主运化与脾主肌肉的关系浅探 周俊亮 刘友章 潘奔前 实用中医内科杂志2006年；20(1)：17-18
4、杨维益，等．脾气虚证大鼠骨骼肌的形态学和形态计量研究[J]．中国运动医学杂志1993；12(3)：157
5、李乐红，等．“脾气虚”大鼠骨骼肌细胞化学研究[J]．中国医药学报1990：5(5)：16
6、王淑娟，马铁明，张立德．脾气虚大鼠肌电图及运动神经传导速度的变化研究[J]．辽宁中医杂志，1998；25(9)：441
7、周平祯，秦小珑，宋军福．脾主肌肉与．K+、Na+、Cl—关系的探讨[J]．江西中医药1995； 6(增刊)：4-5
8、贾钰华，徐复霖，许俊杰，等．脾虚证的微循环和血液流变学同步观察[J]．中医药研究，1991；(6)：55．
9、刘志宏，张桂菊，倪育淳，等．脾肺气虚证与微观血瘀证的相关性分析[J]．中国中医药信息杂志，2001：8(1)：45．
10、章梅，夏天，南耘，等．脾虚患者血浆纤维连接蛋白和巨噬细胞功能的变化[J]．浙江中医学院学报，1999；23(5)：36．
11、沈华，关崇芬 脾虚证的临床和实验免疫研究进展[J]．中国中医基础医学杂志1997；3(3)：57
12、万集今 实验性脾虚小鼠脾脏淋巴细胞增殖周期和免疫细胞化学的研究[J]．中国组织化学与细胞化学杂志1994；3(2)：116
13、刘健，孙弼纲脾虚泄泻患者红细胞免疫功能的临床研究[J]．中国中西医结合杂志1994：14(9)：531
14、章梅，夏天，张仲海．脾虚小鼠红细胞免疫和腹腔巨噬细胞吞噬功能改变的实验研究[J]．北京中医药大学学报，1999：22(3)：26．
15 匡调元，中医病理研究。第二板[M]。上海：上海科技出版社。1989：63
16、许琦，巫燕莉，王建华，等．“脾虚”大鼠经胃泌素刺激胃酸分泌的敏感性及补中益气汤的作用[J]．中药药理与临床，2002；18(5)：2
17、陈奇 中药药理研究方法学北京：人民卫生出版社，1996； 10：23
18、刘学松 利血平致动物脾虚模型机制的研究[J]．中国医药学报，1989；4(5)：6-7
19、陈小野 脾虚证动物模型的造模思路[J]．中医杂志，1993；35(4)：239
20、潘霜，朱智德，窦维华．脾虚证动物模型若干问题的探讨[J]．现代中西医结合杂志，2004：13(9)：1241～1242
21、陈小野，邹世洁，张智，等．大鼠长期脾虚造模的实验研究[J]．中国中医基础医学杂志，1995；1(1)：37～41
22、郭显椿，张生福，毛绍振，等．小白鼠脾虚证模型的复制及某些生理功能的试验观察[J]．中兽医医药杂志，2000；5：4
23、广州中医学院脾胃研究所脾虚患者唾液淀粉酶活性初步观察[J]中华医学杂志1980：60(5)：290
24、劳绍贤．脾虚证候的现代研究概论．新中医，1985：(9)：49
25、李常青 王建华 唾液淀粉酶、D—木糖排泄率和胃电图三者合参对脾虚证的研究[J]湖南中医学院学报1998；(2)：8
26、王建华，连志诚，侯宁脾胃病患者的中医辩证与胃电图检查结果关系的探讨[J]中医杂志1983 24(6)：26
27、脾虚大鼠壁细胞Ca~(2+)／CaM-PK Ⅱ活性的变化及黄芪的作用 张根水，王汝俊 唐惠琼[J]． 中药药理与临床2002；18(6)：19-20
28、脾虚大鼠胃壁细胞胃泌素受体研究及黄芪的作用观察张根水王汝俊[J]．中国中西医结合基础杂志2002；8(6)：44-46
29、脾虚大鼠胃壁细胞胞浆游离钙离子浓度及黄芪对其调节作用的研究 聂克，王汝俊[J]．中药药理与临床2001；17(2)：5—6
30、劳绍贤，赵瞻元，王建华，脾虚证胃肠粘膜线粒体研究及其临床意义，[J]。广州中医药大学学报1991；8(6)：24-25
31、程学仁，王建华，劳绍贤等，脾虚证患者十二指肠吸收细胞线粒体的观察。[J]．安徽中医学院学报，1999；18(5)：33-34
32、邓伟民，劳绍贤．脾虚证胃粘膜主、壁细胞线粒体立体计量学研究及临床意义，[J]．解放军医学杂志，1997；22(2)：130—131
33、李燕舞，王汝俊，王建华，大黄脾虚模型大鼠胃壁细胞的超微结构观察[J]．中国中西医结合消化杂志，2005；13(3)：155-157。
34、广州中医学院脾胃研究所四君子汤对动物离体小肠运动的影响(一)[J]。新中医，1978；(5)：53-54
35、王汝俊，王建华，邵庭荫等，补中益气汤“调理脾胃”的药理作用研究—对胃肠运动及小肠吸收的影响，[J]中药药理与临床1987；3(2)：4-5
36、黄玲，王建华，劳绍贤。党参、蒲公英、川芎及其配伍对胃粘膜损伤的保护作用[J]广州中医药大学学报，1992：9(1)：41
37、黄绍刚 周福生 黄穗平 脾虚瘀热病机在消化性溃疡中的意义[J]．中医杂志2006：47(10)：728—730
38、胡丽娟 周福生消化性溃疡复发机理的研究思路与方法[J]．中医药学刊2004； 22(1)：122-123
39、周福生 程宏辉 祝淑贞心胃相关理论及临床应用[J]浙江中医学院学报2004；28(2)：7-8
40、张庆宏，周福生。析“心胃相关”。[J]云南中医学院学报，2001；24(2)：38-39
41、周福生 许仕杰 黄纯美运用“周易思维”升华中医理论 [J]浙江中医学院学报2005；29(1)：5-8
42：许仕杰，黄纯美，周颖瑜周福生教授“血三脏”与胃肠功能性疾病的相关探讨[J]中医药学刊2005；23(1)：24-27
43：许仕杰，吴栓。周福生教授三脏一体辨证新模式的提出及临床运用[J]。中医药学刊，2004；5(5)：14～16
46、任平，黄熙，张莉 四君子汤对实验性脾气虚大鼠胃排空率的排空影响[J]．中国中西医结合杂志，2000；20(8)：596-597
47、李勇敏，彭淑珍，王福云。健脾消积液对胃肠功能的影响[J]．中国中医药信息杂志，2000；7(2)：21-22
48、崔琦珍，黄志新，劳绍贤等，慢性浅表性胃炎脾胃虚实证钡条胃排空影响[J]．中国中西医结合杂志。2000：20(8)：596-598
49、徐珊，杨青，成信法乐胃饮对脾气虚实验大鼠胃泌素和胃动素的影响[J]．中国医药学报，2004；19(1)：20-22
50、王兆清，程一饮，吴家驹等，“脾”与胃酸分泌功能的初探——附341例分析[J]．中西医结合杂志，1984；4(1)：36
51、金敬善。血清中胃泌素水平与脾气虚证的关系[J]．中国中西医结合杂志，1982：2(1)： 25
52、郑小伟，王颖，宋红，三种脾气虚证模型大鼠血清胃泌素及胃窦G细胞的比较研究[J]．中华中医药杂志，2006；21(6)：318-320
53、封吉化，尚虎虎，黄熙等。脾虚早期与脾虚期大鼠组织和血浆中SS、CCK、MOT含量变化的探讨[J]．中国人民武警医学杂志，2005；16(5)：336-339
54、刘芳，任平，李月彩等。脾气虚证与胆囊收缩素的关系[J]．中国中西医结合消化杂志，2002；10(5)：262-264
55、杨维益，梁嵘，陈家旭，等．脾气虚证与胰腺外分泌功能关系的临床研究[J]．中国中西医结合杂志，1996：16(7)：414
56、曲瑞瑶，曲柏林，曾文红，等．大鼠实验性脾虚证胃电波和胃运动波的研究[J]．中国中西医结合杂志，1994；14(3)：156．
57、郑樨年，黄玉芳，丁金芳，等．脾虚证胃痛与胃窦粘膜D细胞关系的探讨[J]．江苏中医，1990；11(1)：36．
58、裴瑗，李德新．脾阳虚大鼠横纹肌线粒体超微结构及血清肌红蛋白含量的实验研 究[J]．辽宁中医杂志，1991；18(5)：43．
59、李庆明，吴义芳，吴金浪，等．脾气虚证壁细胞线粒体，G细胞分泌颗粒与血清胃泌素，胃粘膜SOD、MDA的变化[J]．中山医科大学学报，1995；16(1)：45．
60、刘友章 脾胃气虚与肝胃不和型胃脘痛患者胃粘膜的扫面电镜观察[J]．广州中医学院学报。1988；(1)：16-19
61、周俊亮，潘佩光，潘奔前中医脾与线粒体的关系探讨[J]．中医药导报2006；12(2)：9-10
62、郑敏磷，中医藏象实质细胞生物学假说[J]．中医药学刊，2004；22(6)：1068-1070
63、李光辉，李锋，陈超等．川芎嗪对大鼠脊髓损伤后线粒体功能的保护作用[J]．中国中医急症，2005；14(10)：991-992
64、杨维益，梁嵘，文平，等．脾气虚证大鼠骨骼肌的形态学和形态计量研究[J]．中国运动医学杂志，1993；12(3)：157
65、魏彦明．脾虚证家兔胃、肠、肝、脾超微结构与微量元素含量[J]．甘肃农业大学学报，1995；30(1)：7
66、劳绍贤，赵瞻元，王建华，等．脾虚证胃肠黏膜线粒体研究及其临床意义[J]．广州中医学院学报，1991：8(4)：264
67、刘健，刘春丽，方朝晖，等．脾虚大鼠心肌细胞超微结构动态变化的实验研究[J]，中医研究，1996；9(6)：12．
68、刘健，刘春丽，方朝晖，等．脾虚大鼠肝细胞超微结构动态变化的实验研究[J]．辽宁中医杂志，1998；25(7)：333
69、季风清，王秀琴，史小林，等实验性脾虚证大鼠肾上腺形态学与细胞化学研究[J]．首都医科大学学报，1997；17(1)：25
70、尹光耀，何雪芬，尹玉芬，等．脾虚证患者胃黏膜线粒体超微结构、微量元素及相关因素的研究[J]．中国中西医结合杂志，1995；15(12)：719
71、陈玉琴 不同程度脾虚证患者甲状腺功能改变的临床研究[J]．安徽中医学院学报，1998；3(1)：10
72、许晴，路欣，史小林，等实验性脾虚证睾丸形态学与细胞化学的研究[J]．首都医科大学学报，1997；17(1)：21
73、魏彦明．脾虚证兔胃肠肝脾超微结构与微量元素含量[J]．甘肃农业大学学报，1995；30(1)：7—12
74、尹光耀，何雪芬，尹玉芬．脾虚证胃病胃粘膜亚细胞结构及其微量元素、DNA研究的临床意义[J]．中国中西医结合脾胃杂志，1996；4(1)：10—15
75、刘尽，曲长江，三种脾虚模型小鼠线粒体超微结构改变的比较研究。[J]中医药学刊，2001；19(4)378—379
76、吴煜，李玉波，尤江云。慢性胃炎脾胃气虚证气滞证与主壁细胞超微结构关系的 研究[J]。中国中西医结合杂志，1997；17(8)：477
77、祁建生，李秀娟，杨春波等，慢性胃炎脾虚证细胞游离Ca~(2+)及膜Ca~(2+)-Mg~(2+)-ATPase研究[J]中国中西医结合脾胃杂志，1999；7(1)：16-17
78、尹光耀，陈一，张武宁等，慢性胃炎脾虚证分型的病理生理学基础[J]，中国中西医结合基础医学杂志，2005；11(4)：298-301
79、Anderson S, Bankier AT, Barrell BG, et al . Sequence and organization of the human mitochondrial genome. Nature, 1981; 290:457
80、Andrews. R. M., Kubacka, I., Chinnery, P. F, et al Reanalysis and revision of the Cambridge reference sequence for human mitochondrial DNA,Nature Genetics 1999:23:147
81、Yakes FM, Van Houten B. Mitochondrial DNA damage is more extensive and Persists longer than nuclear DNA damage in human cells following oxidative stresst. Proc NatlAcad Sci USA, 1997: 94:514
82、Khadakov M, Heflich RH, Manjamatha MG, et al. Accumulation of point mutations in mitochondrial DNA of aging mice[J]. Muratres. 2003:526(1-2):1-7
83、周云丽，牛瑞芳，史玉荣，乳腺癌线粒体基因组控制区突变的研究，中华肿瘤防治杂志，2006；13(14)：1082-10848
84、Fliss MS, Usadel H, Caballero OL, et al. Facile detection of mitochondrial DNA mutations in tumors and bodily fluids [J] .Science, 2000; 287(5460):2017 2019.
85、Kamalidehghan B , Housmand M , Ismail P , et al. Deltemt DNA (4799) is more comman in non-tumoral cells from gastric cancer sample [J], Archmed Res.,2006:37(6):730-735
86、隋桂琴，王陆飞，王桂云LHON患者线粒体基因突变频谱分析中国实验诊断学2006：10(7)：759-762
87、Kaneda H, Hayashi J, Takahama S, et al. Elimination of pateral mitochonial DNA in intraspecific crosses during early mouse embryogenesis. Pre Nat Sci,1995: 92:4542-4546.
88、Galloway C D, Reyholds R L, Herrin G L, et al .The frequency of heteroplasms in tissue types and increase with age. Am J Num Cenet. 2000:66(4):1384-1397
89、余时沧，钱桂生，黄桂君，高蕾。 F16，一种以线粒体为靶点的抗癌分子， 《生命的化学》2004；24(5)：421-423
90、刘键，刘春丽，李平，等110例老年脾虚证的研究[J]．安徽中医学院学报，1996：1(1)：17
91、刘晓颖。脾气虚证与胃粘膜P53基因表达关系的实验研究[J]，中国中医基础医 学杂志，1999；5(3)：15-18
92、尹德辉，王彩霞，李德新等，脾阴虚证衰老模型大鼠的心肌和脑组织线粒体DNA缺失情况[J]，中国临床杂志，2006；10(35)：100-102
93、葛云松，刘杰民。中医脾虚证研究的误区与对策[J]．贵阳中医学院学报，2004；20(1)：6-8。
94、尹耀慧，易振佳，金益强，证侯基因组学深入研究的思考[J]．湖南中医杂志，2006；22(6)：1-3
95、许光照，脾气虚证患者十二指肠的病理形态及组织化学研究[J]．中西医结合杂志，1987：7(12)：722
96、邓伟民，脾虚证胃粘膜主壁细胞线粒体计量学研究及临床意义[J]．解放军医学杂志。1997；11(2)：130-131。
97、Sutourky P ,Morono R D, Ramalho-santos J, et al. Ubiquitin tag for sperm mitochondria. Nature, 1999: 402(6760): 371-372
98、Coller H A, Bedrak N D, Khrapko K. Frequent intracellular clonal expansions of somatic mtDNA mutations significance and mechanisms. Ann Y Acad Sci. 2002;959:434-447
99、Rokes A, Ladoukakis E D, Iouros E. Animal mitochondrial DNA recombination revisited. Trands in Ecology and Evolution. 2003:18:411-417
100、赵兴波，储明显，李宁等，绵羊线粒体DNA的父系遗传。中国科学(C辑)，2000；30(6)： 642-646
101、Awadalla P, Zyre-Walker A, Smith J M. Linkage disequilibrium and recombination in hominial mitochondrial DNA. Science. 1999 ; 286 (5449) :2524-2525
102、Reynier B ,Malthiery Y.A.ccumulation of deletions in mtDNAduring tissue aging: Analysis by long PCR. Beochem Biophys Res Common, 1995: 217(1):59-67